一种检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒，通过样品中的多菌灵与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中多菌灵的含量，通过两种显色液，使检测效果更为灵敏、准确，能够减少误差；通过生物免疫的方法制备出免疫原，能够使酶标板与多菌灵具有较好的灵敏度和相容性，通过多种浓度的多菌灵标准品浓缩液，使用更加方便，减少了检测人员的工作强度，更为适应使用者的需要。

【技术实现步骤摘要】
一种检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒
本专利技术涉及试剂盒
，具体涉及一种检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒。
技术介绍
多菌灵，化学名称2-(甲氧基氨基甲酰)苯并咪唑，是一种高效低毒杀菌剂，可用于防治多种植物病害。多菌灵是一种广谱、内吸性的苯并咪唑类杀菌剂，是蔬菜栽培过程中常用的一种农药，对由真菌引起的多种作物病害有防治效果，可用于叶面喷雾、种子处理和土壤处理等。我国蔬菜产品出口量很大，农药残留是一个很重要的限制指标，多菌灵化学性质稳定，在环境中降解较慢，残留期较长，极易造成其在水果、蔬菜等农作物中的残留超标。毒理学实验证实，一定剂量的多菌灵会引起动物肝脏、生殖器官、分泌器官、免疫系统等异常病理现象，因此，为了保障消费者身体健康，国内外对多菌灵残留要求越来越严格，定期对多菌灵残留进行检测成为许多国家的监控的必要手段，授权公告号CN105403703B的名为“检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其应用”的专利技术专利，采用定量或定性检测样品中多菌灵的含量，但是此专利采用的抗原为多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到的，采用半抗原虽然使样品处理简单，制造简单，但对于有效含量较低的样品，很难准确的测出是否含有多菌灵，导致对于多菌灵残留的测定精度不够的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供了一种检测准确，特异性高的检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种检测多菌灵的ELisa方法，包括如下步骤：步骤一：制备多菌灵抗原：S1:制备人工抗原：将S-甲基异硫脲硫酸盐和氯甲酸甲酯加入去离子水中，采用稀碱液调节至PH＝8.0-8.5，采用冰乙酸调节至PH＝4.5-5.0，加入3，4-二氨基苯甲酸与水，升温至90-95℃反应1-3h，降至室温，过滤，所得滤饼用甲醇打浆，真空干燥，得到目标半抗原；S2:制备免疫抗原：将所述目标半抗原溶于干燥的DMF中，依次加入1-乙基-3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3-4h，得到半抗原活化溶液；称取卵清蛋白加入到碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，得到蛋白溶液；S3:将所述半抗原活化溶液多次添加至蛋白溶液中，15℃下振荡反应24h，完毕，采用PBS进行透析，得到免疫抗原的PBS溶液，分装冷冻保存；通过样品中的多菌灵与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中多菌灵的含量，通过两种显色液，使检测效果更为灵敏、准确，能够减少误差；步骤二：制备多菌灵单克隆抗体：S1:动物免疫：将步骤一得到的所述免疫抗原注入到小鼠体内，使其产生抗血清；S2:细胞融合和克隆化：取产生抗血清的小鼠脾细胞，按数量比5:1与FO骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌多菌灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将所述杂交瘤细胞株进行冻存；采用间接竞争的方法，在酶标板上包被偶联抗原，样本中残留的多菌灵和酶标板预包被的偶联抗原竞争抗多菌灵的酶标二抗，用底物显色，样本的吸光度值与其多菌灵残留的含量成负相关；S3:单克隆抗体的生产与纯化：复苏所述杂交瘤细胞株，采用动物体内诱生单克隆抗体方法，采用杂交瘤细胞株于动物体内进行诱导，使动物体内分泌多菌灵单克隆抗体，10天后采集腹水，进行腹水纯化，-20℃保存，得到纯化多菌灵单克隆抗体，通过腹水纯化能够将杂交瘤细胞株在动物体内诱导产生抗体，通过这种方法能够获得活性较强且特异性较好的抗体；步骤三：酶标二抗的制备：以纯化多菌灵单克隆抗体为免疫原对无病免疫动物进行免疫，得到多菌灵抗抗体；将多菌灵抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标二抗；通过生物免疫的方法制备出免疫原，能够使酶标板与多菌灵具有较好的灵敏度和相容性；步骤四：酶标板的制备：制备包被抗原，将包被抗原4-6℃避光孵育16h，洗涤静置30s，拍干，加入封闭液，37℃避光孵育2h，倾去液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存，得到酶标板；步骤五：检测多菌灵的酶联免疫试剂盒的组建。进一步的，步骤二中，所述杂交瘤细胞株的冻存步骤：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存；进一步的，步骤二中，所述杂交瘤细胞株的复苏步骤：复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。进一步的，步骤四中，所述包被抗原的制备方法为：将所述目标半抗原溶于干燥的DMF中，依次加入1-乙基-3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3-4h，得到包被活化抗原溶液；称取牛血清蛋白加入到碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，得到牛血清蛋白溶液；将所述包被活化抗原溶液多次添加至蛋白溶液中，15℃下振荡反应24h，完毕，采用PBS进行透析，得到完全抗原的PBS溶液，分装冷冻保存。进一步的，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的PH为9-10。采用检测多菌灵的ELisa方法的试剂盒，包括酶标板、多菌灵标准品浓缩液溶液、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液和复溶液，通过样品中的多菌灵与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中多菌灵的含量。进一步的，所述复溶液为pH值为7.0、0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。进一步的，所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为过氧化脲，所述B液为四甲基联苯胺。进一步的，终止液为摩尔浓度为1.8-2.2mol/L的硫酸溶液。进一步的，洗涤液包括吐温-20、浓度为2-4g/L的叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述吐温-20占洗涤液重量百分比的0.01-0.02％。与现有技术相比，本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术提供的一种检测多菌灵的ELisa方法及其试剂盒，通过样品中的多菌灵与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中多菌灵的含量，通过两种显色液，使检测效果更为灵敏、准确，能够减少误差；通过生物免疫的方法制备出免疫原，能够使酶标板与多菌灵具有较好的灵敏度和相容性，通过多种浓度的多菌灵标准品浓缩液，使用更加方便，减少了检测人员的工作强度，更为适应使用者的需要。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的描述。实施例1：步骤一：制备多菌灵抗原：S1:制备人工抗原：将S-甲基异硫脲硫酸盐(1eq)、氯甲酸甲酯(2eq)加入去离子水中，缓慢滴加25％氢氧化钠水溶液至PH＝8.0，用冰乙酸调整PH＝5.0，加入3，4-二氨基苯甲酸(1eq)与水，完毕升温至95℃反应2h，降至室温，过滤，所得滤饼用甲醇打浆，真空干燥得到目标半抗原；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测多菌灵的ELisa方法，其特征在于：包括如下步骤：/n步骤一：制备多菌灵抗原：/nS1:制备人工抗原：将S-甲基异硫脲硫酸盐和氯甲酸甲酯加入去离子水中，采用稀碱液调节至PH＝8.0-8.5，采用冰乙酸调节至PH＝4.5-5.0，加入3，4-二氨基苯甲酸与水，升温至90-95℃反应1-3h，降至室温，过滤，所得滤饼用甲醇打浆，真空干燥，得到目标半抗原；/nS2:制备免疫抗原：将所述目标半抗原溶于干燥的DMF中，依次加入1-乙基-3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3-4h，得到半抗原活化溶液；/n称取卵清蛋白加入到碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，得到蛋白溶液；/nS3:将所述半抗原活化溶液多次添加至蛋白溶液中，15℃下振荡反应24h，完毕，采用PBS进行透析，得到免疫抗原的PBS溶液，分装冷冻保存；/n步骤二：制备多菌灵单克隆抗体：/nS1:动物免疫：将步骤一得到的所述免疫抗原注入到小鼠体内，使其产生抗血清；/nS2:细胞融合和克隆化：取产生抗血清的小鼠脾细胞，按数量比5:1与FO骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；/n利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌多菌灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将所述杂交瘤细胞株进行冻存；/nS3:单克隆抗体的生产与纯化：复苏所述杂交瘤细胞株，采用动物体内诱生单克隆抗体方法，采用杂交瘤细胞株于动物体内进行诱导，使动物体内分泌多菌灵单克隆抗体，10天后采集腹水，进行腹水纯化，-20℃保存，得到纯化多菌灵单克隆抗体；/n步骤三：酶标二抗的制备：/n以纯化多菌灵单克隆抗体为免疫原对无病免疫动物进行免疫，得到多菌灵抗抗体；/n将多菌灵抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标二抗；/n步骤四：酶标板的制备：/n制备包被抗原，将包被抗原4-6℃避光孵育16h，洗涤静置30s，拍干，加入封闭液，37℃避光孵育2h，倾去液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存，得到酶标板；/n步骤五：检测多菌灵的酶联免疫试剂盒的组建。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测多菌灵的ELisa方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：制备多菌灵抗原：
S1:制备人工抗原：将S-甲基异硫脲硫酸盐和氯甲酸甲酯加入去离子水中，采用稀碱液调节至PH＝8.0-8.5，采用冰乙酸调节至PH＝4.5-5.0，加入3，4-二氨基苯甲酸与水，升温至90-95℃反应1-3h，降至室温，过滤，所得滤饼用甲醇打浆，真空干燥，得到目标半抗原；
S2:制备免疫抗原：将所述目标半抗原溶于干燥的DMF中，依次加入1-乙基-3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应3-4h，得到半抗原活化溶液；
称取卵清蛋白加入到碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，得到蛋白溶液；
S3:将所述半抗原活化溶液多次添加至蛋白溶液中，15℃下振荡反应24h，完毕，采用PBS进行透析，得到免疫抗原的PBS溶液，分装冷冻保存；
步骤二：制备多菌灵单克隆抗体：
S1:动物免疫：将步骤一得到的所述免疫抗原注入到小鼠体内，使其产生抗血清；
S2:细胞融合和克隆化：取产生抗血清的小鼠脾细胞，按数量比5:1与FO骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；
利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌多菌灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将所述杂交瘤细胞株进行冻存；
S3:单克隆抗体的生产与纯化：复苏所述杂交瘤细胞株，采用动物体内诱生单克隆抗体方法，采用杂交瘤细胞株于动物体内进行诱导，使动物体内分泌多菌灵单克隆抗体，10天后采集腹水，进行腹水纯化，-20℃保存，得到纯化多菌灵单克隆抗体；
步骤三：酶标二抗的制备：
以纯化多菌灵单克隆抗体为免疫原对无病免疫动物进行免疫，得到多菌灵抗抗体；
将多菌灵抗抗体与辣根过氧化物酶进行偶联得到酶标二抗；
步骤四：酶标板的制备：
制备包被抗原，将包被抗原4-6℃避光孵育16h，洗涤静置30s，拍干，加入封闭液，37℃避光孵育2h，倾去液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存，得到酶标板；
步骤五：检测多菌灵的酶联免疫试剂盒的组建。


2.根据权利要求1所述的一种检测多菌灵的ELisa方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢宝驹，
申请(专利权)人：北京奥本生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11