高度纯化的重组人胰岛素(RHI)API及其生产方法技术

公开了用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)的方法，所述高度纯化的RHI的纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质(不包括如USP所规定的有关物质脱酰胺Asn

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高度纯化的重组人胰岛素(RHI)API及其生产方法
本公开介绍了用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)及其组合物的方法。所述高度纯化的RHI适合用作RHI药物产品的活性药物成分(API)。
技术介绍
人胰岛素是调节葡萄糖代谢的激素。所述人胰岛素蛋白由两条多肽链组成—20个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链，总共51个氨基酸。所述A和B多肽链通过A链半胱氨酸和与之配对的相应B链半胱氨酸之间的二硫键连接。所述二硫键和相应的半胱氨酸(Cys)是CysA7-CysB7、CysA20-CysB19和CysA6-CysA11。重组人胰岛素被证明是用于糖尿病患者的治疗性组合物。糖尿病的特征在于由于胰岛素缺乏导致血糖水平升高和/或肝葡萄糖产生增加。重组人胰岛素可以通过皮下注射或静脉内注射给予患者。使用重组DNA技术合成重组人胰岛素API的基本技术在本领域是公知的。但是，将这些基本技术实施成稳健的生产/合成过程的技术挑战仍然是困难的技术挑战，因为在重组人胰岛素API的生产过程中产生类型和数量不同的杂质。而且，不同的制药公司在重组人胰岛素生产/合成过程中可能产生不同的杂质，因为不同的公司可以采用不同的生产工艺策略、不同的起始材料(例如单链前体(SCP)的序列不同)、不同的用于基因表达的表达宿主细胞等。在本公开中，“人胰岛素”或“胰岛素”可以与“重组人胰岛素”或“RHI”可互换和同义使用。目前市场上的RHI药物产品含有一定水平的杂质。总杂质的典型水平在约1-2％(w/w)的范围内(不包括如美国药典(USP)对RHI所规定的有关物质脱酰胺AsnA21-人胰岛素(“脱酰胺AsnA21-RHI”))，这些总杂质中的一些在RHI药物成品(例如溶液)中产生，其可以随时间而增加，而这些总杂质中的一些则存在于API中。因此，具有较少杂质的RHIAPI将为具有较少杂质的RHI药物产品提供基础。由此，本领域需要高纯度的RHIAPI。本公开涉及生产基于RHIAPI的总重量，总杂质(不包括如USP所规定的有关物质脱酰胺AsnA21-RHI)不超过0.8％(w/w)的RHIAPI的方法，该RHIAPI以下称作“高度纯化的重组人胰岛素API”，或“高度纯化的RHIAPI”。另外，某些杂质可能难以除去，例如RHI的B链第31位处乙酰化的赖氨酸(赖氨酸B31，LysB31或KB31)，本文称为“杂质C(ImpurityC)”或“杂质C(impurityC)”。特别地，在SCP加工成RHI之前，所述杂质C前体在SCP物料中可高达约2-3％(w/w)。杂质C前体的一个例子是SCP中乙酰化的LysC1，其可能在SCP的合成过程中已经生成。由A链、B链、C肽和前导序列组成的SCP的合成，可以利用主宿主细胞(即大肠杆菌)通过瑞士辉凌国际中心(Ferring)开发的发酵方法进行。参见，例如，辉凌的欧洲专利No.EP0871474B1，名称为“人胰岛素的产生”；申请提交日1994年12月29日，授权日2007年3月1日。本公开寻求在诸如辉凌进行的工作基础上继续和显著改善，例如显著减少总杂质(不包括如USP所规定的有关物质脱酰胺AsnA21-RHI)和杂质C，以便生产用作API的高度纯化的RHI。即使在SCP加工成RHI的过程中应用了数次纯化操作之后，杂质C在最终纯化的RHIAPI组合物中作为杂质仍然可以高达0.7％(w/w)。所以，为了生产高度纯化的RHIAPI，需要在RHI的生产/合成过程中减少杂质C的量的技术方案。因此，本公开通过提供用于生产基于RHIAPI的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质(不包括有关物质脱酰胺AsnA21-RHI)为0.8％或更低和杂质C为0.1％(w/w)或更低的RHIAPI的方法，解决该技术问题。本公开还提供基于RHIAPI的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质(不包括有关物质脱酰胺AsnA21-RHI)为0.8％或更低和杂质C为0.1％(w/w)或更低的RHIAPI的组合物。另外，本公开介绍了基于RHIAPI的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质(不包括有关物质脱酰胺AsnA21-RHI)为0.8％或更低、杂质C为0.1％(w/w)或更低和杂质E为0.2％(w/w)或更低的RHIAPI的组合物及用于生产所述RHIAPI的方法。
技术实现思路
本公开的示例性实施方案至少解决了上述问题和/或缺点，并且通过提供至少下面描述的优点来推进本领域。本公开的示例性实施方案的附加目的、优点和突出特征对于本领域技术人员来说将从下面的详细描述中变得显而易见，该详细描述结合附图公开了本公开的示例性实施方案。用于生产高度纯化的RHIAPI的方法首先，本公开提供了用于生产基于RHIAPI的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质为0.8％或更低和杂质C为0.1％(w/w)或更低的高度纯化的重组人胰岛素(RHI)活性药物成分(API)的方法。总杂质不包括脱酰胺AsnA21-RHI，并且杂质C是乙酰化的LysB31-RHI。在优选的实施方案中，本公开中介绍的方法生产固体形式的高度纯化的RHIAPI，基于固体形式的高度纯化的的RHIAPI的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低。在其它实施方案中，所公开的方法生产液体形式的RHIAPI，基于液体形式的RHIAPI的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低。另外，所公开的方法生产固体形式或液体形式的RHIAPI，基于RHIAPI的总重量，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质(不包括有关物质脱酰胺AsnA21-RHI)为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低，和杂质E为0.2％(w/w)或更低。如本文所定义，“高度纯化的重组人胰岛素API”或“高度纯化的RHIAPI”是指基于RHIAPI的总重量，总杂质为0.8％(w/w)或更低的重组人胰岛素API(固体形式或液体形式)。“总杂质(Totalimpurity)”或“总杂质(Totalimpurities)”是指除有关物质脱酰胺AsnA21-RHI外的RHIAPI中的所有杂质。为了本文的简洁，基于RHIAPI的总重量，总杂质为0.8％(w/w)或更低的RHIAPI被称为“高度纯化的RHIAPI”。例如，基于RHIAPI的总重量，纯度为99.0％(w/w)或更高、总杂质为0.8％(w/w)或更低和杂质C为0.1％(w/w)或更低的RHIAPI被认为是“高度纯化的RHIAPI”。正如本文将要描述的，高度纯化的RHIAPI是使用本公开中介绍的方法生产的高度纯化的RHIAPI。USP指南关于RHI规定RHI的总杂质不包括有关物质脱酰胺AsnA21-RHI。在一些实施方案中，用于生产高度纯化的RHIAPI的方法包括：使用赖氨酸保护基团保护单链前体(SCP)上的两个赖氨酸残基，其中SCP具有[(前导肽)-(B链)-(C肽)-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)活性药物成分(API)的方法，所述方法包括：/n使用赖氨酸保护基团保护单链前体(SCP)上的两个赖氨酸残基，其中所述SCP具有[(前导肽)-(B链)-(C肽)-(A链)]的结构式，其中所述C肽是由Arg

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180925 US 62/736,4151.一种用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)活性药物成分(API)的方法，所述方法包括：
使用赖氨酸保护基团保护单链前体(SCP)上的两个赖氨酸残基，其中所述SCP具有[(前导肽)-(B链)-(C肽)-(A链)]的结构式，其中所述C肽是由ArgC2-LysC1组成的短肽，其中所述两个赖氨酸残基是所述SCP的C肽的第1残基(C1)处的第一个赖氨酸残基(LysC1)，和所述SCP的B链的第28残基(B28)处的第二个赖氨酸残基(LysB28)；
酶切所述SCP以产生ArgC2-LysC1-RHI；
应用第一次柱纯化操作以从所述ArgC2-LysC1-RHI中分离所述前导肽，从而生成ArgC2-LysC1-RHI；
对半酶切所述ArgC2-LysC1-RHI中的C肽以产生LysC1-RHI和杂质C，其中所述杂质C是乙酰化的LysB31-RHI；
使所述LysC1-RHI中的两个赖氨酸残基脱保护；
应用第二次柱纯化操作以从所述LysC1-RHI中分离一种或多种杂质；
对所述LysC1-RHI应用第三次柱纯化操作以将所述LysC1-RHI中的杂质C的量减少至基于所述LysC1-RHI的总重量的0.1％(w/w)或更低；
酶切所述LysC1-RHI以产生LysC1和所述RHI；
应用第四次柱纯化操作以从所述RHI中分离一种或多种杂质，从而产生用作所述API的高度纯化的RHI；和
使所述高度纯化的RHIAPI结晶以产生固体形式的高度纯化的RHIAPI；
其中所述方法生产固体形式的高度纯化的RHIAPI，其纯度为99.0％(w/w)或更高，总杂质为0.8％(w/w)或更低，其中所述总杂质不包括脱酰胺AsnA21-RHI，和所述杂质C为0.1％(w/w)或更低，其中w/w表示重量比重量并基于所述固体形式的高度纯化的RHIAPI的总重量。


2.权利要求1所述的方法，其中，所述固体形式的高度纯化的RHIAPI的纯度为99.3％(w/w)或更高，总杂质为0.5％(w/w)或更低，所述总杂质不包括脱酰胺AsnA21-RHI，和所述杂质C为0.1％(w/w)或更低。


3.权利要求1所述的方法，其中，对半酶切所述ArgC2-LysC1-RHI中的C肽的步骤包括向所述ArgC2-LysC1-RHI应用羧肽酶(CPB)以产生LysC1-RHI。


4.权利要求3所述的方法，其中，酶切所述ArgC2-LysC1-RHI的步骤包括在约8.0到约10.0的pH下向所述ArgC2-LysC1-RHI应用所述CBP。


5.权利要求1所述的方法，其中，将所述杂质C的量减少至0.1％(w/w)或更低的所述第三次柱纯化操作包括应用采用C18柱的反相高效液相色谱(RP-HPLC)以从所述LysC1-RHI中分离所述杂质C。


6.权利要求5所述的方法，其中，将所述杂质C的量减少至0.1％(w/w)或更低的所述第三次柱纯化操作包括在所述RP-HPLC中采用水性溶液，所述水性溶液包含(NH4)2SO4、异丙醇(IPA)或其组合。


7.权利要求5所述的方法，其中，将所述杂质C的量减少至0.1％(w/w)或更低的所述第三次柱纯化操作在约2.5到约3.0的pH下进行。


8.权利要求5所述的方法，其中，所述RP-HPLC采用制备柱。


9.权利要求5所述的方法，其中，所述RP-HPLC采用半制备柱。


10.权利要求1所述的方法，其中，所述第一次柱纯化操作和所述第二次柱纯化操作各自采用阴离子柱层析。


11.权利要求1所述的方法，其中，所述第三次柱纯化操作和所述第四次柱纯化操作各自采用RP-HPLC。


12.权利要求11所述的方法，其中，所述第三次柱纯化操作和所述第四次柱纯化操作各自采用具有C8柱的RP-HPLC。


13.权利要求11所述的方法，其中，所述第三次柱纯化操作和所述第四次柱纯化操作各自采用具有C8柱的RP-HPLC。


14.权利要求1所述的方法，其中，所述赖氨酸保护基团包含柠康酸酐、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz，z)、烯丙氧羰基(Alloc)或其组合。


15.权利要求1所述的方法，其中，酶切所述SCP以产生ArgC2-LysC1-RHI的步骤包括向所述SCP应用胰蛋白酶。


16.权利要求15所述的方法，其还包括使用抑肽酶除去所述胰蛋白酶。


17.权利要求1所述的方法，其中，酶切所述LysC1-RHI以产生RHI的步骤包括应用CPB。


18.权利要求1所述的方法，其还包括使用复性缓冲剂使所述SCP复性。


19.权利要求1所述的方法，其中，在所述第二次柱纯化操作被分离的所述一种或多种杂质至少包含ArgC2。


20.权利要求1所述的方法，其中，在所述第四次柱纯化操作被分离的所述一种或多种杂质至少包含LysC1。


21.权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步将杂质E的量减少至0.2％(w/w)或更低，其中所述杂质E是ThrB30缺失-RHI，由此生产高度纯化的RHIAPI，分别基于所述固体形式或液体形式的高度纯化的RHIAPI的总重量，其纯度为99.0％(w/w)，总杂质为0.8％(w/w)或更低，杂质C为0.1％(w/w)或更低，和杂质E为0.2％(w/w)或更低。


22.一种用于生产高度纯化的重组人胰岛素(RHI)的方法，所述方法包括：
使用赖氨酸保护基团保护单链前体(SCP)上的至少两个赖氨酸残基，其中所述SCP具有[(前导肽)-(B链)-(C肽)-(A链)]的结构式，其中所述C肽至少包含ArgC2-LysC1，其中所述赖氨酸残基包含所述SCP的C肽的第1残基(C1)处的第一个赖氨酸残基(LysC1)，和所述SCP的B链的第28残基28(B28)处的第二个赖氨酸残基(LysB28)；
酶切ArgC2-LysC1-RHI以产生LysC1-RHI和杂质C，其中所述杂质C是乙酰化的LysB31-RHI；
使所述LysC1-RHI中的赖氨酸残基脱保护；
应用多次柱层析操作以产生用作API的高度纯化的RHI，其中至少一次所述柱纯化操作将所述LysC1-RHI中的杂质C的量减少至基于所述LysC1-RHI的总重量的0.1％(w/w)或更低；
酶切所述LysC1-RHI以产生RHI；和
使所述高度纯化的的RHIAPI结晶以产生固...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·丁，A·薄，J·Y·张，M·Z·罗，Z·包，
申请(专利权)人：美药星制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US