与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP及其特异性引物和应用制造技术

本发明专利技术涉及分子标记领域，具体涉及与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP及其特异性引物和应用。本发明专利技术通过对311份一年生辣椒材料进行全基因组关联分析，找到了位于6号染色体上与控制辣椒素含量显著相关的SNP位点，并确定了候选基因Capana06g001204，在此基因上有1个与辣椒素含量显著关联的SNP位点，设计了相关CAPS引物加以应用。本研究利用大样本量进行关联分析，使得SNP相关分子标记具有更广泛的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP及其特异性引物和应用
本专利技术涉及分子标记领域，具体涉及与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP及其特异性引物和应用。
技术介绍
辣椒果实辣味的形成由于辣椒素类物质的合成，辣椒素类物质含量在辣椒中呈现出数量性状遗传，前人报道辣椒素类物质含量定位到了较多的数量性状位点(Quantitativetraitlocus,QTL)，Yarnes等(2012)将辣椒素类物质含量定位到了6个染色体上的12个QTL位点；BenChaim等(2006)将其定位到4号染色体；Blum等通过BSA(Bulkedsegregantanalysis)将一个主效QTL定位到7号染色体，Zhu等(2019)也在7号染色体定位到了控制辣椒素类物质含量的主效QTL，并确定了候选基因Pun3，此基因为转录因子MYB31；Nimmakayala等(2016)利用94份辣椒材料，通过全基因组关联分析(Genomewideassociatedstudy,GWAS)，找到了14个与辣椒素和二氢辣椒素含量显著关联的SNPs；Lee等(2016)将辣椒素含量的QTL位点定位到3号和6号染色体，将二氢辣椒素含量的QTL位点定位到2号染色体。通过前人的报道可知，辣椒素类物质含量的遗传比较复杂，在不同的遗传背景下有很大的差异，在多个染色体多个区段均有控制相关性状的基因，对于此遗传性状相关基因及分子标记的利用需要结合不同的遗传背景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的应用。本专利技术的再一目的是提供与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的特异性引物。本专利技术的再一目的提供上述与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的特异性引物的应用。本专利技术的再一目的提供鉴定辣椒果实辣椒素含量的方法。本专利技术提供了与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的应用，其中，在染色体22820065bp位点处的碱基为T时，则辣椒素含量小于2000mg/kg；此处碱基为C时，则辣椒素的含量大于2000mg/kg。根据本专利技术的与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的特异性引物的核苷酸序列为：前引物为F：5’CCTTCTGCTTAGGAGAGACACGACA3’，后引物为R：5’CCCACATTCTGCCTTTGCCATGAAT3’。本专利技术提供了上述特异性引物的应用，所述特异性引物用于鉴定辣椒果实的辣椒素含量。本专利技术提供了鉴定辣椒果实的辣椒素含量的方法，所述方法包括使用与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的特异性引物进行PCR鉴定的步骤，所述特异性引物的核苷酸序列为：前引物为F：5’CCTTCTGCTTAGGAGAGACACGACA3’，后引物为R：5’CCCACATTCTGCCTTTGCCATGAAT3’。根据本专利技术的鉴定辣椒果实的辣椒素含量的方法，其中，PCR扩增产物为140bp，PCR产物经SspI酶切产物，所述SNP位点为碱基T时，可以酶切开，酶切产物经呈现2条条带，则辣椒素小于2000mg/kg；SNP位点为变异类型碱基，即为C时，不能酶切开，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳呈现1条条带，辣椒素的含量大于2000mg/kg。本专利技术通过对311份一年生辣椒材料进行全基因组关联分析，找到了位于6号染色体上与控制辣椒素含量显著相关的SNP位点，并确定了候选基因Capana06g001204，在此基因上有1个与辣椒素含量显著关联的SNP位点，设计了相关CAPS引物加以应用。本研究利用大样本量进行关联分析，使得SNP相关分子标记具有更广泛的应用范围。附图说明图1显示PCR扩增结果，其中，a.琼脂糖电泳PCR扩增产物，M，markerD2000，PCR扩增产物长度为140bp；b.聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR扩增并经SspI酶切产物，M，markerD2000，1-6为参考基因组基因型，7-11为突变型。具体实施方式实施例1对311份一年生辣椒(CapsicumannuumL.)重测序，测序平台为IlluminaSolexa，采用Trimmomaticv0.33处理原始数据，去除接头、poly-N和低质量片段，得到cleandata，利用BWA0.75将cleandata比对到Zunla-1基因组数据(Qinetal.,2014)，设置参数为aln-o1-e10-t4-l32-i15-q10；利用Samtools0.1.19(Lietal.,2009)，采用Bayesian算法，设置参数-q1-C50-S-D-m2-F0.002-u，运行命令mpileup，查找SNP，过滤SNP，设置最小基因等位频率大于0.01，缺失率小于0.1。对311份一年生辣椒(CapsicumannuumL.)果实去除种子和果柄后，55-60℃烘干，用粉碎机研磨成粉末，采用超高效液相色谱(UPLC)测定辣椒素含量，辣椒素提取和测定方法参照农业行业标准，对上述过滤得到的SNP与辣椒素辣椒素含量数据进行全基因组关联分析，全基因组关联分析采用Gemma(ZhouandStephens2012)中的线型混合模型，在6号染色体有显著相关信号，查找此位点附近基因，Capana06g001204在辣椒素合成时期的胎座种有较高表达的基因，因此将Capana06g001204定为控制辣椒素含量的候选基因。在此基因上Chr06：22820065bp处有与辣椒素含量显著相关的非同义突变SNP，参考基因组此碱基为T，变异碱基为C。统计142份辣椒材料的辣椒素含量与在Chr06：22820065bp处的碱基类型，此位点基因型与辣味高低有较好的对应关系。当辣椒素含量以2000mg/kg为阈值时，小于2000mg/kg的材料中有88.64％在此位点碱基为T；大于2000mg/kg的材料中有100％在此位点碱基为C；总体统计结果显示，第Chr06：22820065bp碱基对材料辣椒素含量高低的鉴定准确率为89.44％。对此SNP位点设计dCAPS引物，前引物为F：CCTTCTGCTTAGGAGAGACACGACA，后引物为R：CCCACATTCTGCCTTTGCCATGAAT，PCR扩增产物140bp，琼脂糖凝胶电泳如图1中的a所示。图1中的b所示，聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR扩增并经SspI酶切产物，1-6为参考基因组基因型，7-11为突变型，SNP位点为参考基因组类型，即为T时，可以酶切开，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳呈现2条条带，则辣椒素小于2000mg/kg；SNP位点为变异类型碱基，即为C时，不能酶切开，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳呈现1条条带，辣椒素的含量大于2000mg/kg。针对此突变位点所设计分子标记为候选基因内部分子标记，对此基因的鉴定准确率100％，对于分子标记辅助选择育种具有重要意义。序列表<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所<120>与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的应用，其中，所述SNP位于辣椒第6号染色体22820065bp位点，此处的碱基为T时，辣椒素含量小于2000mg/kg，此处碱基为C时，则辣椒素的含量大于2000mg/kg。/n

【技术特征摘要】
1.与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的应用，其中，所述SNP位于辣椒第6号染色体22820065bp位点，此处的碱基为T时，辣椒素含量小于2000mg/kg，此处碱基为C时，则辣椒素的含量大于2000mg/kg。


2.与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为：
前引物为F：5’CCTTCTGCTTAGGAGAGACACGACA3’，后引物为R：5’CCCACATTCTGCCTTTGCCATGAAT3’。


3.权利要求2所述的与控制辣椒果实辣椒素含量紧密连锁SNP的特异性引物的应用，其特征在于，所述特异性引物用于鉴定辣椒果实辣椒素的含...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亚从，王立浩，于海龙，程锋，张宝玺，张正海，张亢，陈姝敏，张伟丽，景雅欣，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11