一种香菇L868菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法，该指纹图谱由7对基于香菇全基因组测序后开发的InDel标记组成。本发明专利技术的香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱可用于香菇L868菌种的特异性鉴定，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的44个香菇菌种中具有香菇L868菌种的专一性。

【技术实现步骤摘要】
一种香菇L868菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法
本专利技术属于香菇菌种的检测领域，具体涉及一种香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法。
技术介绍
香菇(Lentinulaedodes(Berk.)Pegler)因具有较高的营养价值和药用价值，而备受消费者欢迎。中国是世界上最早进行香菇人工栽培的国家，栽培历史已有800多年，目前香菇是国内栽培最广、产量最高的菇种。据中国食用菌协会统计，2018年中国食用菌总产量为3842.04万吨，其中香菇总产量为1043.12万吨，占国内食用菌总产量的27.12％，占世界香菇总产量的90％以上。近年来香菇产业成为国内精准扶贫的重要抓手，据统计全国超过20％以上的国家级贫困县选择香菇作为重要产业，我国香菇栽培规模进一步扩大，但随着我国香菇产业的快速发展，香菇生产用种“同种异名，异种同名”的问题日益突出，这不仅损害了香菇育种者的知识产权更为生产者造成了极大地风险，为香菇产业进一步发展造成了隐患。为保障育种者的权益和降低生产者的风险，促进我国香菇产业健康、稳定和可持续发展，建立一种简便、快速、可靠的香菇菌种特异性鉴定技术迫在眉睫。随着生物信息学的快速发展，DNA测序技术的不断成熟，测序的通量在不断增加而成本在降低。DNA分子标记技术能够从基因水平上检测香菇菌种的遗传特异性，香菇全基因组测序的完成为InDel标记的开发提供了便利。InDel分子标记是一种基于高通量测序技术的应用，降低了InDel标记开发的成本，适用于香菇全基因组测序分子标记的开发。且InDel标记具有数量丰富、准确性高、稳定性好、快捷简便等优点，不仅用于分子标记辅助育种，而且也可用于香菇菌株鉴定。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。本专利技术的一种香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱，该指纹图谱由7对InDel标记组成，是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的InDel标记引物，扩增带型好，重复性高，标记详细信息如表1。表1InDel标记引物信息列表本专利技术还提供了一种香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组插入/缺失片段开发的7对InDel标记引物，对香菇菌种进行InDel标记扩增，将得到的带型与L868菌种的带型对照，与该带型一致即为香菇L868菌种；其中香菇L868菌种的带型编号组合为：0(1+2)1(1+2)11(1+2)。通过对收集的44个香菇品种的InDel标记引物带型扩增，本专利技术确定了7对InDel标记引物在44个香菇品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同InDel等位位点的编号组合可有效识别L868菌种(图2-8)。通过DNA分子量对照D2000bpDNAladder可确定各InDel标记引物扩增的等位位点的相对分子量，存在L868菌种特异InDel等位片段组合的菌种，即是香菇L868菌种，该菌种的编号组合为：0(1+2)1(1+2)11(1+2)。表2InDel引物扩增的等位片段信息汇总表本专利技术还提供了上述香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基PDA中，23～22℃下避光培养，10d后收集菌丝；(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2-3颗钢珠；②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；③加入62℃预热1h的2×CTAB抽提液，于62℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800uL；⑤在上述上清液中加入体积比为22：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中的上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心2min；⑨弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行全基因组InDel标记的PCR扩增；PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：PremixTaqTM(1.22U/22μLTaqDNA酶，0.4mM/LdNTP，0.3mM/LPCRbuffer)10μL，10μmol/LInDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O6μL；PCR反应条件：94℃2min；94℃42second，22-60℃42second，72℃30second，32个循环；72℃7min；10℃保存；电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物，点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2％，电泳缓冲液为1×TAE，电压90v，电流300mA，功率100W，电泳2h，拍照，分析结果；采用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过DNA分子量对照D2000bpDNAladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：0(1+2)1(1+2)11(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇L868菌种。本专利技术的有益效果本专利技术的香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱可用于L868菌种的鉴别，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3-4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国44个香菇菌种中具有L868菌种的专一性，具有良好的应用前景。附图说明图1为香菇L868菌种InDel标记指纹图谱，其中M是D2000bpDNAladder，数字1-7代表的是所用的7对InDel标记引物，箭头所指的是香菇L868菌种的特异性InDel等位片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，包括：/n(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到PDA平板上，25℃下避光培养，10d后收集菌丝；/n(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：/n①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2-3颗钢珠；/n②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；/n③加入65℃预热1h的2×CTAB抽提液，于65℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；/n④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装为两管各800μL；/n⑤在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；/n⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；/n⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；/n⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心5min；/n⑨弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL 10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；/n⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；/n(3)InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行开发的InDel标记的PCR扩增；/nPCR扩增体系为：总体积20μL，包括：Premix Taq...

【技术特征摘要】
1.一种香菇L868菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，包括：
(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到PDA平板上，25℃下避光培养，10d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2-3颗钢珠；
②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；
③加入65℃预热1h的2×CTAB抽提液，于65℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；
④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装为两管各800μL；
⑤在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；
⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；
⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心5min；
⑨弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；
⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；
(3)InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行开发的InDel标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：PremixTaqTM(1.25U/25μLTaqDNA酶，0.4mM/LdNTP，0.3mM/LPCRbuffer)10uL，10μmol/LInDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA2μL、ddH2O6μL；
PCR反应条件：94℃5min；94℃45second，55-60℃45second，72℃30second，35个循环；72℃7min；10℃保存；
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1×TAE，电压90v，电流300mA，功率100W，电泳5h，拍照，分析结果；
选用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照DNA分子量对照D2000bpDNAladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：0(1+2)1(1+2)11(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇L8...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海龙，章炉军，沈秀芬，宋春艳，尚晓冬，谭琦，张美彦，张丹，李巧珍，李玉，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31