一种烟草δ（24）-固醇还原酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种烟草δ(24)‑固醇还原酶基因及其应用，δ(24)‑固醇还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本申请中，通过对特定δ(24)‑固醇还原酶基因的初步研究，发现其与烟草叶片中豆甾醇含量高度相关，在本氏烟草中将该基因沉默，烟草叶片中豆甾醇含量发生了明显降低，降低了27.9％，而甾醇总量变化不明显。基于这一特性，可利用基因工程手段，为烟叶品质调控、烟草新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草δ(24)-固醇还原酶基因及其应用
本专利技术属于烟草基因工程领域，具体涉及一种烟草δ(24)-固醇还原酶基因及其应用。
技术介绍
植物甾醇是生物膜系统的重要组成成分，可以调控植物生长发育，响应多种生物和非生物胁迫。甾醇类物质约占烟叶质量的0.1％～0.3％，烟草中的甾醇类化合物主要有胆甾醇(cholesterol)、豆甾醇(stigmasterol)、菜油甾醇(campasterol)、和β-谷甾醇((β-sitosterol)等。已有文献报道其中的豆甾醇是卷烟烟气苯并芘的重要来源。因此，降低烟草成熟叶片中豆甾醇含量可有效降低卷烟烟气苯并芘含量。目前植物中甾醇的合成代谢已有研究，但栽培烟草中调控豆甾醇合成的基因却鲜有报道。烟草中影响豆甾醇含量的基因功能研究将为烟叶安全性改善、烟草品种遗传改良提供理论支持，对提高我国烟草产品安全性具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草δ(24)-固醇还原酶基因及其应用，以改善烟草中豆甾醇含量，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定基础。为实现上述专利技术目的，本申请采用如下技术方案：一种烟草δ(24)-固醇还原酶基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，含有1695个碱基，命名为NtDHCR24。进一步的，烟草δ(24)-固醇还原酶基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，由564个氨基酸残基组成。进一步的，烟草δ(24)-固醇还原酶基的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：>(1)提取基因组，并反转录为cDNA备用；(2)设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：NtDHCR24-F：5’-AAGTTGGAGATTGTCTTGAGTG-3’，NtDHCR24-R：5’-CAGTTGGCGGCATTTCTC-3’。进一步的，在步骤(1)中提取基因组时，以烟草品种红花大金元叶片为样品。上述任一项的烟草δ(24)-固醇还原酶基因的应用，利用基因沉默技术，通过调节烟草甾醇δ(24)-固醇还原酶的表达量，来调节控制烟叶中豆甾醇含量。进一步的，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有烟草δ(24)-固醇还原酶基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体，转化烟草，筛选获得豆甾醇含量变化的烟草新品种。具体例如：利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)的技术，干扰烟草δ(24)-固醇还原酶基因的表达使其沉默，烟草δ(24)-固醇还原酶基因沉默植株中豆甾醇含量显著下降，进而获得豆甾醇含量下降的植物新品种。本专利技术的有益效果是：基于甾醇对植物生长发育和对烟叶安全性的重要作用，对烟草甾醇调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，为改善烟草品种奠定良好应用基础。本申请中，通过对特定烟草δ(24)-固醇还原酶基因NtDHCR24的初步研究，发现其与烟草叶片中豆甾醇含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草叶片中豆甾醇含量发生了降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。附图说明图1为与对照植株相比，NtDHCR24基因沉默植株中该基因的相对表达量；图2为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的甾醇含量比较。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细的说明，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本专利技术的技术方案，而不能解释为是对本专利技术技术方案的限制。在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。生物材料：本氏烟草，一种现常用烟草材料，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cm×10cm)中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理。下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体(tobaccorattlevirus，TRV)，所具体利用的TRV2(一种常用载体)带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoRI和BamHI等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。实验试剂：LB液体培养基，1L含量中含有：10g细菌蛋白胨(bacteriologicalpeptone)；10g氯化钠(NaCl)；5g酵母抽提物(yeastextract)，高温高压灭菌。YEB液体培养基，1L含量中含有：5g牛肉浸膏(beefextract)；5g细菌蛋白胨(bacteriologicalpeptone)；5g蔗糖(sucrose)；1g酵母抽提物(yeastextract)；2mL1M硫酸镁(MgSO4)，高温高压灭菌。1M2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用。200mM乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)储备液：二甲基亚砜(DSMO)溶解，-20℃储存备用。实施例1本实施例就烟草NtDHCR24基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。(1)烟草NtDHCR24基因克隆根据前期对于烟草基因组及相关NtDHCR24基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：NtDHCR24-F：5’-AAGTTGGAGATTGTCTTGAGTG-3’，NtDHCR24-R：5’-CAGTTGGCGGCATTTCTC-3’。以烟草红花大金元叶片(先提取基因组，再反转录为cDNA)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtDHCR24基因；PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，34个循环后，72℃彻底延伸5min；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。(2)构建重组TRV2-NtDHCR24载体将步骤(1)中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4DNA连接酶进行连接。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/LKan的LB固体培养基上，37℃过培养夜。挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2-NtDHCR24。实施例2在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，进一步将所构建的重组TRV2-NtDHCR24载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。(1)转化农杆菌需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，制备了TRV2-GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草δ(24)-固醇还原酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟草δ(24)-固醇还原酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的烟草δ(24)-固醇还原酶基因，其特征在于，烟草δ(24)-固醇还原酶基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1或2所述的烟草δ(24)-固醇还原酶基因，其特征在于，烟草δ(24)-固醇还原酶基因的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：
(1)提取基因组，并反转录为cDNA备用；
(2)设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：
NtDHCR24-F：5’-AAGTTGGAGATTGTCTTGAGTG-3’，
NtDHCR24-R：5’-CAGTTGGCGGCATTTCTC-3’。


4.根据权利要求3所述的烟草δ(24)-固醇还原酶基因，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾婉俐，许力，黄海涛，陈千思，李晶，杨文武，米其利，刘欣，向海英，邓乐乐，蒋佳芮，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53