一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种KPC‑2单克隆抗体及其制备方法和应用，其中KPC‑2单克隆抗体制备过程包括：合成肺炎克雷伯菌KPC‑2基因，表达纯化KPC‑2蛋白，以重组KPC‑2蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS‑1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得了KPC‑2蛋白单克隆抗体。本申请所获得的KPC‑2单克隆抗体均能与KPC‑2蛋白结合；且所得的KPC‑2单克隆抗体的效价在200万以上，且KPC‑2蛋白的单克隆抗体，纯度高、特异性强、灵敏度高，可用于制备用于检测KPC‑2基因诊断试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫治疗生物医药领域，具体涉及一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
KPC-2首先在肺炎克雷伯菌中被发现，产KPC-2型碳青霉烯酶菌株在世界各地均有报道，已发现其宿主菌包括肺炎克雷伯菌、产酸克雷菌、阴沟肠杆菌、沙门菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌，甚至铜绿假单胞菌，表明KPC型基因在不同种属甚至科间具有很强的传播能力。重视对碳青霉烯类耐药株的检测，防止产KPC酶株的爆发流行显得尤为重要，也是抗感染面临的新挑战。而现有的KPC-2检测方法特异性差、耗时长，延误患者的诊断和治疗；现有技术KPC-2蛋白的单克隆抗体，纯度效价低、特异性差。因此，建立一种灵敏、快速、特异性好的KPC-2检测诊断方法和制备纯度效价高、特异性强的KPC-2蛋白的单克隆抗体具有重要的临床应用价值。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的诸多缺陷，提出一种KPC-2单克隆抗体及其制备方法和应用，本专利技术制备了6株KPC-2单克隆抗体，制备的单克隆抗体纯度效价高、特异性强，具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种KPC-2单克隆抗体，包含1D7与4B2单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区；该单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为如下(1)～(2)：/n(1)所述1D7单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述1D7单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；/n(2)所述4B2单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述4B2单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种KPC-2单克隆抗体，包含1D7与4B2单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区；该单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为如下(1)～(2)：
(1)所述1D7单克隆抗体的重链可变区具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，所述1D7单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列；
(2)所述4B2单克隆抗体的重链可变区具有如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列，所述4B2单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQIDNO.5所示的氨基酸序列。


2.一种权利要求1所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：合成肺炎克雷伯菌KPC-2基因，表达纯化KPC-2蛋白，以重组KPC-2蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得KPC-2蛋白单克隆抗体。


3.根据权利要求2所述的KPC-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
步骤1)：KPC-2基因的合成
从GenBank序列数据库中获取肺炎克雷伯菌KPC-2基因的氨基酸序列；依据大肠杆菌的密码子偏好性进行KPC-2基因的碱基序列的密码子优化，并合成密码子优化后的基因序列；
步骤2)：KPC-2基因的表达和纯化
将KPC-2基因连接至pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达；收集菌体，高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱进行再次精细纯化，获得了纯度较高的KPC-2重组蛋白，收集KPC-2蛋白作为抗原备用；
步骤3)：小鼠的免疫
用纯化的KPC-2蛋白作为抗原，免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，常规免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60μg/只，进行加强免疫一次；
步骤4)：NS-1骨髓瘤细胞的制备
于融合前一周，将保存在液氮中的NS-1骨髓瘤细胞复苏，培养在25cm2细胞培养瓶中，用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/mL；融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清DMEM培养液，将细胞轻轻吹下，移入50mL离心管，400g离心5分钟，洗涤细胞3次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用；
步骤5)：免疫脾细胞的制备
取免疫效果最好的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，将消毒好的小鼠固定好，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入40μm细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；400g离心5min，洗涤细胞3次，弃上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用；
步骤6)：细胞融合
将NS-1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，400g离心10min，吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在lmin内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG溶液1mL；并不断用移液管轻轻搅拌细胞1min；然后向细胞混合物中加入10mlDMEM培养基，第一分钟逐滴滴入lmL，第二分钟加lmL，第3min-4min加3mL，5min后加其余的5mL；将细胞混合物置于37℃水浴孵育15min；然后400g离心5min，除去上清，用20ml15％胎牛血清DMEM培养基重悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪涛，邬玉兰，刘丽，陈钰羊，林启辉，任燕，许少坚，
申请(专利权)人：深圳市龙华区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44