一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体3C12制造技术

本发明专利技术公开了一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体3C12，所述纳米抗体具有独特的CDR区，与抗绿脓杆菌外毒素A具有极高的亲和力，本还公开了筛选所述纳米抗体的方法。所述方法操作简单、筛选周期短，既避免了噬菌体污染的风险，又提高了筛选效率，大大较少了工作量，经济成本低，适合于工业化的大批量筛选要求。

【技术实现步骤摘要】
一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体3C12本专利技术专利申请是申请日为2018年2月12日，申请号为CN201810143471.6的中国专利技术专利申请“一种利用流式细胞分选筛选纳米抗体的方法”的分案申请。
本专利技术公开一种纳米抗体，属于多肽

技术介绍
1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体抗体H2，其主要是IgG2和IgG3类型。此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(heavychain-only-likeAntibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识，这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，从而形成一种重链二聚体。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，那么如何快速筛选出具有较高亲和力、易于表达的纳米抗体在生物研究与临床治疗领域均具有重要意义。目前最常用的纳米抗体筛选方法为噬菌体表面展示技术。该方法的筛选过程又被称之为生物淘洗，筛选原理是利用靶分子和相应配体间特异亲和力进行的，也称之为亲和筛选。首先将靶分子固相化，加入噬菌体库使其充分作用。含有与靶分子能特异结合的配体噬菌体克隆结合到固相化的靶分子上，其余未结合的噬菌体克隆被洗脱掉。再用酸性缓冲液或游离的靶分子洗脱结合的噬菌体克隆。收集洗脱的噬菌体感染大肠杆菌进行扩增。扩增获得的噬菌体投入下一轮筛选。通过“吸附-洗脱-扩增”多次循环式的筛选，最终洗脱的噬菌体克隆经初步结合试验鉴定后，分别挑取单个克隆测序，根据所获序列确定所筛选抗体的基本氨基酸序列。噬菌体表面展示技术具有筛选容量大、方法简单具有循环性的优点，但是该方法很难建立库容高、多样性丰富的抗体文库，且噬菌体操作起来具有易污染、易扩散、难控制等特点。中国专利CN106282214A公开了一种快速获得纳米抗体的方法及其应用，所述方法包括从免疫羊驼外周血中获取PBMC细胞，通过流式细胞术筛选，并提取阳性细胞的RNA，以反转录获得的cDNA模板，通过两轮PCR筛选获得靶片段，最后通过表达载体转化入宿主菌并经过免疫学鉴定而获得分泌目标抗体的克隆。相对于传统的噬菌体淘洗技术，该流式细胞术筛选实验步骤简单，周期短、成本低。但是由于存在RNA提取和反转录的步骤，而RNA是极易被污染和降解的物质，因此难以保证足够高的筛选库容量，以致后续的反转录和PCR扩增极易受到模板特异性和数量的影响，从而导致筛选失败或者筛选周期延长。针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的就是提供一种筛选周期短、操作简单且多样性好、效率高、无噬菌体污染的抗体筛选方法及通过该方法获得的纳米抗体。
技术实现思路
基于上述目的，本专利技术首先提供了一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQIDNO.11所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.12所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.13所述氨基酸序列组成。在一个优选的实施方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQIDNO.14所述氨基酸序列组成，具有该可变区的纳米抗体在本专利技术中被命名为“3C12”。其次，本专利技术提供了编码所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，所述核苷酸序列由SEQIDNO.15所示。最后，本专利技术提供了上述抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体的筛选方法，所述方法步骤包括：(1)收集被免疫靶抗原的骆驼科动物的外周血B淋巴细胞；(2)应用靶抗原通过流式细胞术分选所述B淋巴细胞为单细胞，其中，所述靶抗原和所述B淋巴细胞分别被颜色相异的显色染料所标记，所述流式细胞术分选为双色筛选；(3)将分选好的单个B淋巴细胞直接加热冷却后进行逆转录反应生成cDNA；(4)以cDNA为模板，PCR扩增抗体重链序列并回收扩增产物；(5)以步骤(4)扩增产物为模板，PCR扩增抗体的CH1与CH2序列编码基因；(6)以步骤(5)扩增为阴性的步骤(4)扩增产物为模板，PCR扩增抗体的VHH片段编码基因；(7)将步骤(6)获得的VHH片段克隆入表达载体，并在宿主菌中表达所述VHH片段；(8)鉴定步骤(7)表达的纳米抗体。在一个优选的实施方案中，所述靶抗原被异硫氰酸荧光素所标记，B淋巴细胞被藻红蛋白标记。在一个更为优选的实施方案中，所述藻红蛋白采用生物标记法，其中，先由抗B淋巴细胞的一抗与B淋巴细胞特异性结合，再由标记了藻红蛋白的二抗与一抗特异性结合。更为优选地，所述一抗为抗羊驼panB细胞单克隆抗体，所述二抗为兔抗鼠IgM。在另一个优选的实施方案中，步骤(1)所述骆驼科动物为羊驼。在另一个优选的实施方案中，步骤(7)所述表达载体为pMES4载体。在另一个优选的实施方案中，步骤(7)所述宿主菌为BL21(DE3)。本专利技术提供的抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体具有独特的CDR区，与绿脓杆菌外毒素A显示了极高的亲和力，BiacoreT100蛋白相互作用分析系统显示亲和力为2.77E-08。另外，本专利技术还提供了筛选所述纳米抗体的方法，所述方法将流式细胞术分选与反转录技术、PCR筛选相结合，建立起了一种快速高效的纳米抗体筛选方法，并通过分选细胞直接反转录,避免了现有技术中提取总RNA反转录带来的污染和RNA量损耗的技术问题，由于单个细胞的cDNA量极少，直接使用针对VHH的特异性引物是无法扩增出纳米抗体序列的，在现有技术的基础上，本专利技术在PCR筛选的技术环节，增加了第二轮对常规抗体的反向筛选，同时也减少了纳米抗体筛选过程中的干扰背景，极大地提高了筛选效率。本专利技术提供的纳米抗体筛选方法操作简单、筛选周期短、既避免了噬菌体污染的风险，又提高了筛选效率，大大较少了工作量，经济成本低，适合于工业化的大批量筛选要求。...

【技术保护点】
1.一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.11所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.12所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.13所述氨基酸序列组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQIDNO.11所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQIDNO.12所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQIDNO.13所述氨基酸序列组成。


2.根据权利要求1所述抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQIDNO.14所述氨基酸序列组成。


3.一种编码权利要求2所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，所述核苷酸序列由SEQIDNO.15所示。


4.权利要求1或2所述抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体的筛选方法，所述方法步骤包括：
(1)收集被免疫靶抗原的骆驼科动物的外周血B淋巴细胞；
(2)应用靶抗原通过流式细胞术分选所述B淋巴细胞为单细胞，其中，所述靶抗原和所述B淋巴细胞分别被颜色相异的显色染料所标记，所述流式细胞术分选为双色筛选；
(3)将分选好的单个B淋巴细胞直接加热冷却后进行逆转录反应生成cDNA；
(4)以cDNA为模板，PCR扩增抗体重链序列并回收扩增产物；
(5)以步骤(4)扩增产...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，刘原源，于建立，周宇杭，李飞，古一，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44