一种NDM-1单克隆抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种NDM‑1单克隆抗体的制备方法及其应用，步骤为：合成肺炎克雷伯菌NDM‑1基因，表达纯化NDM‑1蛋白，以重组NDM‑1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS‑1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得7株NDM‑1蛋白单克隆抗体，并通过测序获得了其中4株单克隆抗体的氨基酸序列；为建立NDM‑1的检测方法奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种NDM-1单克隆抗体的制备方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种NDM-1单克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)是一种在2008年新被发现的金属酶(MBL)，因其首次在印度的新德里发现而得名，分离自一位瑞典的印度籍患者，携带菌株为肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。随后，在全球范围内超过20个国家出现了NDM-1耐药菌的报道，越来越多的数据表明产NDM-1的耐药菌已经呈全球范围播散趋势，有可能成为威胁人类健康的巨大隐患，引发了全球性的恐慌。据报道，NDM-1在革兰阴性杆菌中广泛存在，主要分布于肠杆菌科和不动杆菌属中的细菌，现已经在肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和变形杆菌属中发现NDM-1耐药细菌存在。研究表明，NDM-1是通过质粒介导的，转入细菌后可自由复制，在细菌之间传递，人员之间接触传播：同时携带这个基因的质粒通常整合了多种耐药基因如大环内酯类、氨基糖苷类、利福平、磺胺甲噁唑、单环β-内酰胺类，从而使细菌对多种抗生素产生耐药性。NDM-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NDM-1单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：合成肺炎克雷伯菌NDM-1基因，表达纯化NDM-1蛋白，以重组NDM-1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得NDM-1蛋白单克隆抗体，并通过测序获得单克隆抗体的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种NDM-1单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：合成肺炎克雷伯菌NDM-1基因，表达纯化NDM-1蛋白，以重组NDM-1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合，通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞，用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水，再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得NDM-1蛋白单克隆抗体，并通过测序获得单克隆抗体的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的NDM-1单克隆抗体的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
步骤1)：NDM-1基因的合成
从GenBank序列数据库中获取肺炎克雷伯菌NDM-1基因的氨基酸序列；依据大肠杆菌的密码子偏好性进行NDM-1基因的碱基序列的密码子优化，并合成密码子优化后的基因序列；
步骤2)：NDM-1基因的表达和纯化
将NDM-1基因连接至pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达；收集菌体，高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱进行再次精细纯化，获得了纯度较高的NDM-1重组蛋白，收集NDM-1蛋白作为抗原备用；
步骤3)：小鼠的免疫
用纯化的NDM-1蛋白作为抗原，免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，常规免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60μg/只，进行加强免疫一次；
步骤4)：NS-1骨髓瘤细胞的制备
于融合前一周，将保存在液氮中的NS-1骨髓瘤细胞复苏，培养在25cm2细胞培养瓶中，用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/mL；融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清DMEM培养液，将细胞轻轻吹下，移入50mL离心管，400g离心5分钟，洗涤细胞3次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用；
步骤5)：免疫脾细胞的制备
取免疫效果最好的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，将消毒好的小鼠固定好，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入40μm细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；400g离心5min，洗涤细胞3次，弃上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用；
步骤6)：细胞融合
将NS-1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50mL离心管中混匀，400g离心10min，吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在lmin内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG溶液1mL；并不断用移液管轻轻搅拌细胞1min；然后向细胞混合物中加入10mlDMEM培养基，第一分钟逐滴滴入lmL，第二分钟加lmL，第3min-4min加3mL，5min后加其余的5mL；将细胞混合物置于37℃水浴孵育15min；然后400g离心5min，除去上清，用20ml15％胎牛血清DMEM培养基重悬细胞沉淀，并转移至75cm2细胞培养瓶中，置于细胞培养箱孵育16-24h；将融合后的细胞悬液转移到50ml离心管，400g离心10min；去除上清，细胞沉淀用2.5mL15％胎牛血清DMEM培养基重悬，加入22.5mL半固体培养基混匀后倒入直径3.5cm的平皿中，每个平皿2mL，37℃，5％CO2培养；十天后肉眼可见平皿的培养基表面有肉眼可见的白色细胞克隆团；
步骤7)：阳性杂交瘤细胞筛选
无菌条件下将平皿中的细胞团吸起放入96孔板培养液中，继续培养4天；4天后进行间接ELISA检测；同时用免疫前正常小鼠血清为阴性对照，免疫后小鼠血清作阳性对照...

【专利技术属性】
技术研发人员：林启辉，汪涛，任燕，许少坚，邬玉兰，刘丽，
申请(专利权)人：深圳市龙华区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44