一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用。本发明专利技术从日本七鳃鳗的肠组织中克隆得到了LjGSDM基因，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示，该基因编码的蛋白LjGSDM，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。本发明专利技术的基因LjGSDM编码的蛋白能够识别并结合到细菌细胞膜上，并通过寡聚成孔将细胞膜裂解从而杀死细菌。同时LjGSDM不能从细胞外裂解细胞，用药时对宿主的细胞没有毒性是比较安全的杀菌肽，可用于制备治疗感染性疾病的药物。可用于制备治疗感染性疾病的药物。可用于制备治疗感染性疾病的药物。

Expression and application of ljgsdm, a cell membrane porogen

【技术实现步骤摘要】
一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用。

技术介绍

[0002]七鳃鳗(Lampetra japonicum)是一种古老的无颌类脊椎动物，体型细长类似鳗鱼，在眼睛的后面身体两侧各有七个鳃孔，所以由此得名。根据现存的七鳃鳗化石人们发现其出现在恐龙之前，是目前海洋动物中最原始的脊椎动物。是无脊椎动物进化成鱼类的一个中间点，在脊椎动物演化的过程中地位非常特殊。近年来，关于七鳃鳗的抗菌免疫方面的研究引起了广泛的关注，并在七鳃鳗中发现了不少具有重要意义的免疫相关基因。
[0003]细胞焦亡(Pyroptosis)是近年来新命名的一种程序性细胞死亡方式，它由Gasdermin家族蛋白介导在机体的抗菌感染过程中发挥关键作用。Gasdermin家族蛋白是介导细胞焦亡的核心分子，在高等哺乳动物中除了PJVK以外，Gasdermin家族蛋白的每个GSDM分子都有两个结构域：N
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terminal成孔结构域和C
‑
terminal抑制结构域。正常状态下这两个结构域相互“勾连”起来，处于自抑制状态。当被Caspase切割活化后会释放N
‑
terminal成孔结构域。N端成孔结构域具有亲脂性能够与细胞内膜上的脂质结合并在细胞膜上聚集打孔。所以Gasdermin家族蛋白的N
‑
terminal成孔结构域具有诱导细胞焦亡以及杀菌的作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：提供一种LjGSDM蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本专利技术在七鳃鳗的基因组中发现了Gasdermin家族蛋白的同源基因LjGSDM，但是LjGSDM只有一个成孔结构域没有抑制结构域，而且在静息状态下它在机体中的表达水平非常低，基因克隆的难度非常大。但是当七鳃鳗受到细菌感染后LjGSDM的表达水平会显著增加，特别是在腮和肠中上调表达的最为显著。同时我们还发现七鳃鳗的LjGSDM与其他Gasdermin家族蛋白不同，它不经过切割活化就能够特异性的识别并结合到细菌的细胞膜上，通过在细胞膜上寡聚成孔而裂解原生质体和细菌，对细菌的杀伤作用非常大。但是由于宿主细胞外膜与细菌细胞膜所含的脂质不同，LjGSDM不能够从细胞外裂解细胞，对宿主的细胞没有毒性，属于比较安全的抗菌肽。这种特性使得LjGSDM蛋白在制备治疗感染性疾病的药物以及在水产养殖业、医药卫生等领域具有广阔的开发应用前景。
[0007]本专利技术LjGSDM蛋白由289个氨基酸编码，等电点和分子量分别为8.7和31081.98道尔顿。
[0008]本专利技术同时提供一种LjGSDM基因，编码所述的LjGSDM蛋白。
[0009]作为本专利技术所述LjGSDM基因的优选实施方式，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]本专利技术还提供包含所述LjGSDM基因的重组载体。
[0011]作为本专利技术所述重组载体的优选实施方式，所述载体为真核表达载体。
[0012]本专利技术提供包含所述LjGSDM基因的重组细胞。
[0013]作为本专利技术所述重组细胞的优选实施方式，所述细胞为HEK293T细胞。
[0014]本专利技术还提供一种表达LjGSDM蛋白的方法，包括以下步骤：
[0015](1)用权利要求4或5所述的重组载体转化适于其表达的细胞，获得重组细胞；
[0016](2)将重组细胞进行培养后，裂解细胞回收并纯化得到所表达的LjGSDM蛋白。
[0017]作为本专利技术所述方法的优选实施方式，具体包括以下步骤：
[0018](1)将权利要求2或3所述的LjGSDM基因克隆到真核表达载体pFXB
‑5’
Flag，得到表达载体pFXB
‑
LjGSDM；
[0019](2)将pFXB
‑
LjGSDM转化HEK293T细胞，转染后将转染了目的基因的293T细胞传入细胞培养皿；
[0020](3)细胞在细胞培养皿中生长20
‑
30h后，去除细胞培养基，再向细胞培养皿中加入含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液对细胞进行裂解；
[0021](4)将细胞裂解液转入离心管，离心后取上清液，加入M2Affinity Gel、4℃旋转过夜；
[0022](5)次日将结合了目的蛋白的Affinity Gel离心去上清，并用IP裂解液洗涤；
[0023](6)向洗涤后的Affinity Gel中加入IP裂解液和3
×
FLAG peptide竞争1h后，离心收集上清蛋白溶液。
[0024]本专利技术还摸索和优化了LjGSDM蛋白的纯化条件。由于LjGSDM的杀菌作用太强，目前不能在细菌中大量表达，所以我们在真核细胞中表达并纯化了LjGSDM蛋白，并得到较纯的LjGSDM蛋白。
[0025]本专利技术的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将目的质粒转化E.coli.DH5α菌株，并用含有氨苄青霉素(100μg/mL)的2
×
YT培养基37℃培养转化菌株。最后按照Omega公司质粒提取试剂盒的说明书提取目的质粒。
[0026]本专利技术还提供所述LjGSDM蛋白在制备杀菌产品或治疗感染性疾病药物中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果：
[0028]本专利技术通过细菌刺激从七鳃鳗的肠组织中克隆得到了LjGSDM基因，并构建了表达载体。后续通过细胞LDH、IL
‑
6释放实验、LjGSDM与细胞膜脂质结合实验、细菌原生质体裂解和杀菌实验分析发现，LjGSDM不经过切割活化就能够直接寡聚并定位到细胞膜，并在细胞膜上打孔导致原生质体的裂解和细菌的死亡。但是由于细胞外膜与细菌细胞膜脂质的不同，LjGSDM只能特异的结合在细菌细胞膜上并不能从宿主的细胞外膜上成孔。所以，LjGSDM只能特异性的裂解外源感染的细菌，在使用时对宿主细胞却没有毒性。
附图说明
[0029]图1：扩增得到的LjGSDM基因全长片段；其中M：DNA分子量标准(DL2000)；1
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4号泳道是七鳃鳗的肠组织扩增的LjGSDM基因全长片段。
[0030]图2：重组真核表达载体pFXB
‑
LjGSDM的构建图。
[0031]图3：纯化的LjGSDM蛋白电泳图；其中，1号泳道是纯化的LjGSDM蛋白电泳后的考马斯亮蓝染色图；2号泳道是用Flag标签抗体对纯化蛋白做的WB鉴定图。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LjGSDM蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种LjGSDM基因，其特征在于，编码权利要求1所述的LjGSDM蛋白。3.如权利要求2所述的LjGSDM基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。4.包含权利要求2或3所述LjGSDM基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体为真核表达载体。6.包含权利要求2或3所述LjGSDM基因的重组细胞。7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为HEK293T细胞。8.一种表达LjGSDM蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用权利要求4或5所述的重组载体转化适于其表达的细胞，获得重组细胞；(2)将重组细胞进行培养后，裂解细胞回收并纯化得到所表达的LjGSDM蛋白。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)将权利要求2或3所述的LjGSDM基因克隆到真核表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：元少春，徐安龙，鲁琰，王欣丽，韦旭侠，陈尚武，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：