一种生物冷冻保护剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种生物冷冻保护剂及其制备方法，具体是对深海鱼类AFPⅢ采用人工重组的方法，按来源于pubmed的cDNA文库作为模板，cDNA序列被pET28a克隆载体编码扩增而得到pET

【技术实现步骤摘要】
一种生物冷冻保护剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物技术及医学领域，涉及抗冻蛋白，具体涉及一种人工重组抗冻蛋白及其制备方和其作为生物冷冻保护剂之应用。

技术介绍

[0002]几乎没有生物系统可以在没有冷冻保护剂(CPA)存在的情况下耐受冷冻降温和复温过程。CPA的选择是深低温保存过程中一个关键的步骤。理想的CPA作用应该是迅速而均一地穿透入细胞而不引起过高的渗透压差，有效地结合细胞内水分而抑制冰晶的形成，并且是安全无毒或低毒的。高渗透能力和低分子质量是低温保存过程中CPA发挥保护作用的基础。因此，选择和优化深低温保存液的组成对于成功保存细胞或组织有至关重要的作用。
[0003]进行结构复杂的器官的深低温保存，既要CPA均匀地渗透到各个部位，又要避免其浓度损伤和毒性损害是很困难的。但是器官深低温保存也具备一些有利因素：器官内部布满血管网，大量的毛细血管使器官内的渗透单位远较整体器官推测的数值小，细胞与毛细血管腔之间的距离很小，营养物质、代谢废物和气体等都能以扩散的方式通过。这些条件会促使溶液在灌注过程中有效地分布到整个器官内，而灌注液的成份及成份的变化率，也可通过梯度灌注被较准确地控制。因此，在器官冷冻过程中，要充分利用毛细血管的这种优势，必须先将所需要的细胞外CPA充分灌注到毛细血管网，使其进一步与细胞膜发生渗透作用，从而达到细胞内外的渗透平衡。
[0004]有效抑制冰晶形成是器官成功深低温保存的关键。零下温度形成的冰晶，会对器官组织细胞造成不可逆损伤。抗冻蛋白(Antifreeze Proteins，AFPs)，也称为温度迟滞蛋白，是一种在零下温度环境中抑制冰晶形成和冰晶之间发生重结晶的特殊功能蛋白，具有两种明显活性——热滞活性和重结晶抑制活性。AFPs存在于海洋、极地、高山等环境中的耐寒生物体内，包括深海鱼类、极地昆虫、高山植物、真菌和细菌等，可降低体液的冰点，维持自身非冰冻状态，如南极雪蚤的AFPs可使体液冰点降低6℃由于抗冻蛋白的温度迟滞性质，一些学者将抗冻蛋白应用于食品科学、农业等领域。有学者发现，AFPs在改善冻融食品的质量和产品的储存方面具有潜在的应用价值。
[0005]由于抗冻蛋白的热滞活性和重结晶抑制活性，我们推测可将其作为一种冷冻保护剂应用于医学领域组织器官的深低温保存。目前，来源于深海鱼类的抗冻蛋白，经基因测序鉴定结构较为明确，根据其基因序列和结构特征可分为Ⅰ～Ⅲ型抗冻蛋白AFP和抗冻糖蛋白AFGP (见图1)，且性质稳定。
[0006]目前，仅有一家公司可以提供商品化AFPIII，即A/F Protein Inc，公司位于美国和加拿大，公司网址为www.afprotein.com，AFPIII来源于深海鱼(Americanus)组织分离及提纯，售价为$10/mg，成本较高，同时由于生物制品的进口限制，限制了AFPIII在医学领域的应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的任务是提供一种生物冷冻保护剂及其制备方法。
[0008]实现本专利技术的技术方案是：
[0009]本专利技术提供的生物冷冻保护剂为以下序列所示的重组蛋白：
[0010]MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMNQESVVATQLIPINTALTPIMMKGKVVTPMGIPFKEMSQIV GKQVNRAVPLGTTIMPEMVKGYAPN，即序列表中序列3所示的重组蛋白。
[0011]本专利技术进行了深海鱼Zoarces americanus(ocean pout)天然抗冻蛋白AFPⅢ的人工重组。天然抗冻蛋白AFPⅢ的氨基酸序列为：
[0012]mksviltglf lvllcvdhms sanqesvvat qlipintalt pimmkgkvvt pmgipfkems qivgkqvnra vplgttimpe mvkgyapn，
[0013]序列表中序列1所示的氨基酸序列即为天然抗冻蛋白AFPⅢ蛋白的氨基酸序列，来源于 pubmed数据库，网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABA41372.1？report＝genpept。编码天然抗冻蛋白的核酸序列同样来源于pubmed数据库，具体如下：
[0014]ATGAAGTCAGTCATTTTAACTGGTTTGTTTCTTGTCCTCCTTTGTGTCGACCACATGA GTTCAGCCAACCAGGAGTCCGTGGTGGCCACCCAGCTGATCCCCATAAATACTGCCCTG ACTCCGATAATGATGAAGGGGAAGGTGGTCACCCCAATGGGCATCCCGTTCAAGGAGAT GTCCCAAATCGTGGGAAAGCAAGTGAACAGGGCAGTGCCGTTGGGCACAACCATCATG CCAGAGATGGTGAAAGGGTACGCCCCGAATTAG，即序列表中序列2所示的核酸序列。
[0015]本专利技术将天然抗冻蛋白AFPⅢ的氨基酸序列按照原核表达系统进行密码子优化并基因合成。本专利技术提供的人工重组抗冻蛋白编码基因之核酸序列如下：
[0016]ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAG CCATATGAACCAGGAGTCCGTGGTGGCCACCCAGCTGATCCCCATAAATACTGCCCTGAC TCCGATAATGATGAAGGGGAAGGTGGTCACCCCAATGGGCATCCCGTTCAAGGAGATGT CCCAAATCGTGGGAAAGCAAGTGAACAGGGCAGTGCCGTTGGGCACAACCATCATGCC AGAGATGGTGAAAGGGTACGCCCCGAATTAG，即序列表中序列4所示核酸序列。
[0017]NdeI/XhoI双酶切位点克隆到pET
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28a克隆载体上，N端带His标记。克隆载体示意图，见图2。重组质粒经与AFPⅢ蛋白的cDNA编码序列进行比对，完全符合靶蛋白核酸序列(图 3中划线标示部分)，见图3。
[0018]重组质粒转入BL21表达菌株中进行原核表达，使用E.coli 15℃
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38℃培养，不同温度和培养时间下采用IPTG诱导进蛋白表达(IPTG 0.5
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2mM 15℃
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38℃诱导3
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6h)：离心获得细菌
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天然缓冲裂解液
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纯化(离心分离):上清是天然蛋白质萃取物
→
用变性缓冲液使来自C1 的小球溶解(Urea 8M)
→
纯化(离心分离):上清液是变性蛋白提取液(DPE)
→
PAGE分析NPE (天然蛋白)和DPE(变性蛋白)，见图4。
[0019]重组蛋白的表达条件摸索：16℃及37℃诱导BL21(DE3)，蛋白均不表达，见图5，6。优化条件后，可见重组蛋白的表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中序列3所示。2.权利要求1所述重组蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中序列4所示。4.一种表达权利要求1所述蛋白的重组质粒，其特征在于：包括权利要求2或3所述的编码基因。5.一种重组抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pET
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28a为载体，利用NdeI/XhoI双酶切位点将权利要求2或3所述的抗冻蛋白编码基因插入到pET
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28a克隆载体上，得到重组载体；(2)将步骤(1)得到的测序正确的重组载体转入宿主菌中，然后加入IPTG诱导表达，诱导结束后，经纯化分离获得重组抗冻蛋白AFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘峰，刘迪，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：