太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用。本发明专利技术的抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了上述抗菌肽在制备水产养殖动物的抗水产菌的药物中的应用。本发明专利技术提供了一种新型抗菌肽，并公开了其具有抵抗水产菌的功能，为太湖白鱼养殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。

【技术实现步骤摘要】
太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用


[0001]本专利技术涉及抗菌肽，尤其涉及一种太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用。

技术介绍

[0002]太湖白鱼，学名为翘嘴红鲌(topmouthculter：Erythroculter ilishaeformis)，属于鲤形目、鲤科、鲌亚科、红鲌属。太湖白鱼具有生长速度快和个体大的特点，在红鲌属鱼类当中，生长速度最快，个体最大。由于太湖白鱼肌肉营养价值高，人们对太湖白鱼的需求越来越多，目前太湖流域已开发了大规模的太湖白鱼养殖基地。
[0003]然而，高密度的养殖，也给鱼类带来了大量的养殖病害，例如，细菌感染性疾病。目前，针对养殖鱼类细菌感染性疾病的防治，主要采用的是化学药物治疗为主，生物防治为辅。“药物治疗”虽然见效快，但药物残留现象严重，影响太湖白鱼食用的安全性，还会造成环境污染，限制了养殖业的发展。同时，反复的使用“药物治疗”，特别是抗生素，会加剧细菌耐药性的发生，存在巨大的潜在危害。
[0004]因此，亟待探索太湖白鱼的免疫系统组成特点，抗菌肽的结构、功能与作用机制，以期为太湖白鱼养殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用，本专利技术提供了一种新型抗菌肽，并公开了其具有抵抗水产菌的功能，为太湖白鱼养殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种抗菌肽，该抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为抗菌肽的成熟肽序列。
[0007]进一步地，编码抗菌肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0008]进一步地，抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为抗菌肽的前体。前体属于抗菌肽LEAP-2家族，前体包括了一个信号肽序列(SEQ ID NO.5)、一个前导肽序列(SEQ ID NO.6)和一个成熟肽序列(SEQ ID NO.1)。
[0009]进一步地，编码抗菌肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为抗菌肽的全长cDNA序列，其包含522个碱基，编码了含有92个氨基酸的前体。其全长cDNA序列中还包括聚腺苷酸化位点(aataa)。
[0010]本专利技术的第二个目的是公开上述抗菌肽在制备水产养殖动物的抗水产菌的药物中的应用。
[0011]进一步地，水产养殖动物包括太湖白鱼(Erythroculter ilishaeformis)。
[0012]进一步地，水产菌包括温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、灿烂
弧菌(Vibrio splendidus)和霍乱弧菌中的一种或几种。
[0013]进一步地，抗水产菌的药物中还包括氨苄青霉素。
[0014]进一步地，抗水产菌的药物中抗菌肽和氨苄青霉素的质量比为1:1-4:1。
[0015]借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：
[0016]本专利技术开发了基于太湖白鱼自身免疫系统来源的抗菌肽，明确了其结构、功能与抗水产菌感染机制，为太湖白鱼的养殖过程中细菌性疾病的防治提供有效的候选分子。
[0017]本专利技术的抗菌肽分子量小，一方面可以通过化学合成，另一方面，可以将其编码基因构建到原核或真核表达载体中，通过大规模发酵获得。本专利技术的抗菌肽对水产养殖病原菌，包括耐药菌，具有直接的杀灭作用，且杀菌速度快，而且是致死性的。
[0018]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
[0019]图1是太湖白鱼抗菌肽LEAP-2的分离纯化过程在Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析结果和Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析后的抗菌活性峰的反相液相色谱层析结果；
[0020]图2是太湖白鱼LEAP-2的前体与鲤科鱼类来源的几种LEAP-2的前体比对分析图；
[0021]图3是SEM观察到的PBS和太湖白鱼LEAP-2对嗜水气单胞菌细胞膜形态影响结果。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0023]实施例1：太湖白鱼抗菌肽的分离纯化
[0024]新鲜的太湖白鱼采捕自太湖，体长15～20cm。冰上保鲜，并解剖采集头肾、脾脏、肝脏等免疫相关淋巴组织和器官，加入含有1％(v/v)蛋白酶抑制剂的20mM的PBS(1mL/100mg组织)，并冰上匀浆，加入液氮，反复研磨三次，5000g离心30min，收集上清，低温冻干备用。下一步用Sephadex G-50葡聚糖凝胶过滤层析。将冻干粉溶解于0.1M Na2HPO
4-NaH2PO
4 pH6.0的磷酸盐缓冲液中，上样于已平衡好的Sephadex G-50(Superfine，GE healthcare)葡聚糖凝胶过滤柱(100cm
×
2.6cm)，用同样缓冲液洗脱，并用自动部分收集器进行收集，流速为3mL/管/10分钟，监测收集液280nm处的光吸收，合并各峰冻干，进行抗菌活性检测。抗菌活性峰进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)层析。以水(含0.1％三氟乙酸)：乙腈(含0.1％三氟乙酸)组成的洗脱系统，0.7mL/min进行梯度洗脱，用紫外监测280nm处的光吸收，收集各峰，浓缩冻干，跟踪检测抗菌活性。纯化后的抗菌活性峰，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)UltraFlex I质谱仪(Bruker Daltonics)对纯化到的抗菌多肽的纯度和分子量进行分析。并用Edman降解法对纯化得到的抗菌肽进行N端测序(model 491，ABI，USA)。
[0025]结果如图1所示，太湖白鱼头肾匀浆液上清浓缩后，经Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析后，分为5个洗脱峰，经抗菌检测后，第3个洗脱峰(用箭头指示)具有抗菌活性(图1A)。进一步将Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析的第3个洗脱峰用反相液相色谱法层析，分为约20个洗脱峰，经抗菌检测后，第10个洗脱峰(用箭头指示)具有抗菌活性(图1B)。接着，用质谱
鉴定了图1B中纯化的第10个洗脱峰中含有的抗菌肽LEAP-2的分子量，结果如表1所示，其分子量为4652.17道尔顿。进一步用Edman降解法测序，获得多肽N端的氨基酸序列为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：编码所述抗菌肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的抗菌肽，其特征在于：编码所述抗菌肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。5.权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫林，陈悦，程洪兰，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：