一种寨卡病毒的检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种寨卡病毒的检测方法和试剂盒。本发明专利技术第一方面提供了一种寨卡病毒的检测方法，通过滚环扩增和CRISPR技术联用的方式对寨卡病毒进行检测。本发明专利技术提供的寨卡病毒检测方法，通过滚环扩增和CRISPR技术联用的方式，可用于寨卡病毒的检测，并且具有较高的特异性和灵敏度；此外，该检测方法所需的反应时间较短，并且只需要等温单重荧光通道检测设备，降低了检测成本，适合基层医疗单位推广使用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种寨卡病毒的检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种寨卡病毒的检测方法和试剂盒，属于生物医学


技术介绍

[0002]寨卡病毒属黄病毒科、黄病毒属，主要通过埃及伊蚊、白纹伊蚊叮咬传播，患者会出现的“寨卡热”，表现为发热、丘疹、结膜炎和关节痛等症状，与其他虫媒病毒如登革病毒(dengue virus,DENV)和基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)感染症状相似，同时由于临床样本中病毒载量较低，危险性较高的问题，使寨卡病毒的诊断困难重重。
[0003]近年来，由于疫苗功效减弱、寨卡病毒变异等原因，发病率明显提高。此外，因母体不能将寨卡病毒抗体由胎盘传给胎儿，所以在人婴幼儿时期感染病死率较高。因此，建立一种特异性高、灵敏度高，能够快速准确检测寨卡病毒的方法迫在眉睫。
[0004]病毒分离法是实验室内常用的寨卡病毒诊断方法，其特异性强,但对检测人员的技术和实验室要求高,所需时间长，且只有在病毒血症期才能保证病毒分离较高的成功率，但寨卡病毒感染后约80％的感染者为隐性感染,其病毒血症期短且病毒载量低，导致此方法成功率较低。
[0005]血清学方法是通过对血清中的特异性IgM、IgG抗体或中和抗体进行检测：一般情况下，特异性IgM抗体出现病毒在感染后3
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4d，因此IgM的检测可用于寨卡病毒的早期诊断，但其与登革热病毒等存在较强的抗体交叉反应，诊断结果易发生混淆，特异性不高；特异性IgG抗体在血清中出现较晚，如果IgG检测阳性,一般认为是再次感染或慢性感染，无法用于病毒早期诊断；空斑减少中和试验检测血清抗体的敏感性高，但该试验耗时长、危险性较高，不适合用来做检测。
[0006]核酸检测方法使用较为广泛，例如逆转录
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聚合酶链反应、实时荧光定量法等，其中，逆转录
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聚合酶链反应是先对病毒核酸进行扩增,再通过凝胶电泳对扩增产物进行分析,该方法只能用于定性分析,且在实验过程中需开盖，操作复杂、产物易被污染产生假阳性结果；实时荧光定量法利用探针或染料对病毒RNA进行定量分析,且特异性强、灵敏度高，可有效避免人为操作过程中带来的污染，降低假阳性结果出现的概率，但其需要昂贵的实验设备和经验丰富的实验人员，限制了该方法的广泛应用。
[0007]随着分子生物学的发展，许多新兴分子诊断技术也崭露头角。滚环扩增(RCA)在1998年首次提出，其原理是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式，该方法利用锁式探针与目的基因互补配对连接成环，再利用一种特殊的具有链置换功能的DNA聚合酶，辅以引物，在恒温条件下进行高效的目的核酸扩增，该方法不需要复杂的升降温过程，在恒温状态下就可完成，且扩增结果可直接通过染料查看或探针观察，操作简单便捷，但其缺点是背景较高，有灵敏度的限制。
[0008]因此，如何建立一种特异性高、灵敏度高，能够快速准确诊断寨卡病毒的方法受到了越来越多的关注。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了一种寨卡病毒的检测方法和试剂盒，可对寨卡病毒进行检测，并且具有特异性高、灵敏度高的优点。
[0010]本专利技术第一方面提供了一种寨卡病毒的检测方法，包括如下步骤：
[0011]步骤1：在待测样品、阳性对照样品、阴性对照样品中分别加入连接酶、锁式探针和连接试剂，使所述待测样品与所述阳性对照样品中的核酸与所述锁式探针连接成环，得到连接产物，所述锁式探针具有如SEQIDNO：2所示的序列；
[0012]步骤2：在所述连接产物中加入DNA聚合酶、第一引物、第二引物以及扩增试剂，得到扩增产物，所述第一引物具有如SEQIDNO：3所示的序列，所述第二引物具有如SEQIDNO：4所示的序列；
[0013]步骤3：在所述扩增产物中加入Cas蛋白酶、第一向导RNA、第二向导RNA、荧光探针以及切割试剂，得到切割产物，
[0014]所述第一向导RNA具有如SEQIDNO：5所示的序列，所述第二向导RNA具有如SEQIDNO：6所示的序列，所述荧光探针具有如SEQIDNO：7所示的序列，且其5
’
端和3
’
端分别使用荧光基团和淬灭基团修饰，所述荧光基团为Fam，所述淬灭基团为dab；
[0015]步骤4：对所述切割产物进行荧光检测，根据所述待测样品、阳性对照样品、阴性对照样品的荧光信号判断待测样品中是否含有寨卡病毒。
[0016]进一步地，所述阳性对照样品为寨卡假病毒，所述寨卡假病毒中包括寨卡病毒NS5蛋白的基因，所述基因具有如SEQIDNO：1所示的序列。
[0017]进一步地，所述阴性对照样品为无核酸酶水。
[0018]进一步地，步骤1中，所述连接酶的酶活力为25U/μL，所述锁式探针的浓度为1
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100nM，所述连接试剂包括50mM Tris
‑
HCl、5mM MgCl2、10mM DTT、10
‑
100mM ATP。
[0019]进一步地，所述连接酶为PBCV
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1DNA连接酶或T4 RNA连接酶。
[0020]进一步地，步骤2中，所述DNA聚合酶的酶活力为1U/μL、第一引物的浓度为50
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500nM、第二引物的浓度为50
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500nM；所述扩增试剂包括50mM Tris
‑
HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、1mM dNTP、0.2mg/ml BSA。
[0021]进一步地，所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶。
[0022]进一步地，步骤3中，Cas蛋白酶的浓度为50
‑
200nM、第一向导RNA和第二向导RNA的浓度为100
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400nM，荧光探针的浓度为500nM
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1μM，所述切割试剂包括50mM Tris
‑
HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2和100μg/ml BSA。
[0023]进一步地，所述Cas蛋白为Cas12a蛋白酶、FnCas12a蛋白酶、AsCas12a蛋白酶、LbCas12a蛋白酶、AacCas12b蛋白酶和Cas14蛋白酶中的一种。
[0024]本专利技术第二方面提供了一种用于检测寨卡病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述任一所述检测方法所使用的试剂。
[0025]本专利技术的实施，至少具备如下优势：
[0026]1、本专利技术提供的寨卡病毒检测方法，通过滚环扩增和CRISPR技术联用的方式，可用于寨卡病毒的检测，并且具有较高的特异性和灵敏度；此外，该检测方法所需的反应时间较短，并且只需要等温单重荧光通道检测设备，降低了检测成本，适合基层医疗单位推广使用。
附图说明
[0027]图1为本专利技术实施例1提供的寨卡病毒检测方法的检测结果；
[0028]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寨卡病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：在待测样品、阳性对照样品、阴性对照样品中加入连接酶、锁式探针和连接试剂，使所述待测样品与所述阳性对照样品中的核酸与所述锁式探针连接成环，得到连接产物，所述锁式探针具有如SEQ ID NO：2所示的序列；步骤2：在所述连接产物中加入DNA聚合酶、第一引物、第二引物以及扩增试剂，得到扩增产物，所述第一引物具有如SEQ ID NO：3所示的序列，所述第二引物具有如SEQ ID NO：4所示的序列；步骤3：在所述扩增产物中加入Cas蛋白酶、第一向导RNA、第二向导RNA、荧光探针以及切割试剂，得到切割产物，所述第一向导RNA具有如SEQ ID NO：5所示的序列，所述第二向导RNA具有如SEQ ID NO：6所示的序列，所述荧光探针具有如SEQ ID NO：7所示的序列，且其5
’
端和3
’
端分别使用荧光基团和淬灭基团修饰，所述荧光基团为Fam，所述淬灭基团为dab；步骤4：对所述切割产物进行荧光检测，根据所述待测样品、阳性对照样品、阴性对照样品的荧光信号判断待测样品中是否含有寨卡病毒。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述阳性对照样品为寨卡假病毒，所述寨卡假病毒中包括寨卡病毒NS5蛋白的基因，所述基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述阴性对照样品为无核酸酶水。4.根据权利要求1
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3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤1中，所述连接酶的酶活力为25U/μL，所述锁式探针的浓度为1
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100nM，所述连接试剂包括50mM Tris
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HCl、5mM MgCl2、10mM DTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟，隋国栋，张童，赵望，卢大儒，张新联，刘思秀，姚雨含，朱津辉，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：