一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒及制备使用方法技术

本发明专利技术提供了一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒及制备使用方法，涉及医学临床诊断领域，包括：抗体预包被酶标板、ELA2

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒及制备使用方法


[0001]本专利技术涉及医学临床诊断领域，具体而言，涉及一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒及制备使用方法。

技术介绍

[0002]肺癌是一种发病率高、恶性程度高、预后差的恶性疾病，大部分患者被诊断患有肺癌时，往往已经到晚期，癌细胞发生了远处转移，这也是导致肺癌死亡率高的主要原因。肝脏是肺癌常见的转移部位，约有30％的肺癌患者会出现肝转移，且临床上肝转移早期常呈隐匿经过，检出肝转移对正确分期、制订合理治疗方案和判断预后具有重要意义。因此，建立一个准确、灵敏的检测方法，监测肺癌肝转移是亟待解决的问题。
[0003]目前诊断肺癌患者是否发生肝转移的手段主要有超声、CT及MRI等影像学检查，但由于转移瘤病灶分布及大小等，在临床工作中易被误诊、漏诊。另外，肝穿刺活检也可明确诊断肝转移瘤和寻找原发癌，但这种有创操作有引起腹腔内出血的可能。因此目前缺少一种准确、灵敏的诊断肺癌肝转移的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术或相关技术中存在的技术问题之一，公开了一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒及制备使用方法，基于中性粒细胞胞外诱捕网的理论基础，建立一种操作简便、特异性高的无创检测方法(试剂诊断)，通过采集肺癌患者外周血标本，检测血清中弹性蛋白酶(ELA2)
‑
DNA水平，筛查患者是否发生肝转移。
[0005]本专利技术的第一方面公开了一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒，包括：抗体预包被酶标板、ELA2
‑
DNA标准品、样品稀释液、Anti
‑
DNA
‑
POD抗体、ABTS溶液、ABTS终止溶液和洗涤液，其中，抗体预包被酶标板由纯化抗人ELA2抗体包被制成；ELA2
‑
DNA标准品中含有多个肺癌肝转移患者混合血清；样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和调节酸碱度的盐酸；洗涤液为PBST溶液。
[0006]根据本专利技术公开的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，优选地，样品稀释液具体包括：NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4、HCl和双蒸水。
[0007]根据本专利技术公开的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，优选地，ABTS溶液具体包括：ABTS二胺盐溶液和二硫酸钾溶液；ABTS终止溶液具体包括：十二烷基硫酸钠和去离子水；PBST溶液为含0.05％Tween20的1
×
磷酸盐缓冲液。
[0008]根据本专利技术公开的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，优选地，预包被酶标板为96孔聚苯乙烯透明微孔板。
[0009]本专利技术的第二方面公开了一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，包括：纯化抗人ELA2抗体用0.01mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液稀释成5μg/ml，按每孔100μl的量包被ELISA微孔板，4℃过夜；
[0010]包被步骤完成后，去除ELISA微孔板内的包被液，按每孔160μl的量加入1％BSA封
闭液，4℃封闭过夜；
[0011]封闭步骤完成后，去除ELISA微孔板内的封闭液后制成抗体预包被酶标板；
[0012]收集肺癌肝转移患者血液样本，在4℃温度条件下以3000rmp的速率离心10min，取上清，制成血清样本；
[0013]将血清样本进行5倍稀释，制成稀释样本；
[0014]清洗预包被酶标板，每孔加入100μl稀释样本，设置阴性孔，封板后在25℃温度条件下，以250rmp的速率震荡，孵育120min；
[0015]孵育完成后洗板并拍干；
[0016]将Anti
‑
DNA
‑
POD抗体用样品稀释液20倍稀释，加入反应孔，每孔100μl，封板后在25℃温度条件下，以300rmp的速率震荡，孵育120min；
[0017]反应完成后洗板并拍干；
[0018]每孔加入100μl ABTS溶液，设置空白孔，封板后在25℃温度条件下，以250rmp的速率震荡，孵育20～30min；
[0019]待显色均匀，在每孔加入100μl ABTS终止溶液终止反应，并于405nm处测定OD值；
[0020]根据ELA2
‑
DNA含量数值，将多个肺癌肝转移患者的血清混合；
[0021]另取一酶标板，将纯化的1μg/ml的小牛胸腺DNA作为检测混合血清样本中游离DNA的标准品，使用TE缓冲液稀释1μg/ml小牛胸腺DNA，调整体积为50μl加入酶标板，再向每孔加入50μl的2
×
PicaGreen试剂，使终体系为100μl；
[0022]使用TE缓冲液将混合的血清样本分别做0倍稀释、5倍稀释、25倍稀释，向酶标板中每孔加入50μl的混合血清样本，再向每孔加入50μl的2
×
PicaGreen试剂，使终体系为100μl；
[0023]避光于室温下放置2min～5min，使用多功能酶标仪选择蓝色激发光，检测样品中游离DNA含量；
[0024]对小牛胸腺DNA浓度与OD值进行一元一次方程回归拟合标准曲线，回归方程的相关系数R2＞0.9500；将混合血清样本的OD值代入标准曲线计算出混合血清样本中的游离DNA浓度，并调整为200ng/ml，制成ELA2
‑
DNA标准品。
[0025]根据本专利技术公开的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，优选地，还包括：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，121℃、0.1MPa高压灭菌20min后，制成样品稀释液，室温贮藏备用。
[0026]根据本专利技术公开的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，优选地，还包括：将7mmol/L ABTS二胺盐溶液和4.9mmol/L二硫酸钾(K2S2O8)溶液等体积混合，避光放置12h，用无水乙醇在分光光度计A734nm下调节OD值至0.7，制成ABTS溶液，避光储存备用。
[0027]根据本专利技术公开的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，优选地，还包括：将1g十二烷基硫酸钠(SDS)溶解在100ml去离子水中，制成ABTS终止溶液，储存备用。
[0028]根据本专利技术公开的肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，优选地，还包括：配制含0.05％Tween20的1
×
磷酸盐缓冲液，制成洗涤液。
[0029]本专利技术的第三方面公开了一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒的使用方法，包括：
[0030]取出抗体预包被酶标板恢复至室温，洗板拍干；
[0031]将标准品使用样品稀释液按浓度200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/
ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、0ng/ml进行稀释备用；
[0032]将血清样本使用样品稀释液进行5倍稀释备用；
[0033]抗体预包被酶标板中每本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，包括：抗体预包被酶标板、ELA2
‑
DNA标准品、样品稀释液、Anti
‑
DNA
‑
POD抗体、ABTS溶液、ABTS终止溶液和洗涤液，其中，所述抗体预包被酶标板由纯化抗人ELA2抗体包被制成；所述ELA2
‑
DNA标准品是多个肺癌肝转移患者的混合血清；所述样品稀释液包括磷酸盐缓冲液和调节酸碱度的盐酸；所述洗涤液为PBST溶液。2.根据权利要求1所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液具体包括：NaC1、KCl、Na2HPO4和KH2PO4、HCl和双蒸水。3.根据权利要求1所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，所述ABTS溶液具体包括：ABTS二胺盐溶液和二硫酸钾溶液；所述ABTS终止溶液具体包括：十二烷基硫酸钠和去离子水；所述PBST溶液为含0.05％Tween20的1
×
磷酸盐缓冲液。4.根据权利要求1至3中任一项所述的肺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，所述预包被酶标板为96孔聚苯乙烯透明微孔板。5.一种肺癌肝转移早期诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：纯化抗人ELA2抗体用0.01mol/L pH 9.5的碳酸盐缓冲液稀释成5μg/ml，按每孔100μl的量包被ELISA微孔板，4℃过夜；包被步骤完成后，去除ELISA微孔板内的包被液，按每孔160μl的量加入1％BSA封闭液，4℃封闭过夜；封闭步骤完成后，去除所述ELISA微孔板内的封闭液后制成抗体预包被酶标板；收集肺癌肝转移患者血液样本，在4℃温度条件下以3000rmp的速率离心10min，取上清，制成血清样本；将所述血清样本进行5倍稀释，制成稀释样本；清洗所述预包被酶标板，每孔加入100μl所述稀释样本，设置阴性孔，封板后在25℃温度条件下，以250rmp的速率震荡，孵育120min；孵育完成后洗板并拍干；将Anti
‑
DNA
‑
POD抗体用样品稀释液20倍稀释，加入反应孔，每孔100μl，封板后在25℃温度条件下，以300rmp的速率震荡，孵育120min；反应完成后洗板并拍干；每孔加入100μlABTS溶液，设置空白孔，封板后在25℃温度条件下，以250rmp的速率震荡，孵育20～30min；待显色均匀，在每孔加入100μl ABTS终止溶液终止反应，并于405nm处测定OD值；根据ELA2
‑
DNA含量数值，将多个肺癌肝转移患者的血清混合；另取一酶标板，将纯化的1μg/ml的小牛胸腺DNA作为检测混合血清样本中游离DNA的标准品，使用TE缓冲液稀释1μg/ml小牛胸腺DNA，调整体积为50μl加入酶标板，再向每孔加入50μl的2
×
PicaGreen试剂，使终体系为100μl；使用TE缓冲液将混合的血清样本分别做0倍稀释、5倍稀...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘镭，钮淋，许倩，郭娜，李琳，徐颖，李祥伶，
申请(专利权)人：承德医学院，
类型：发明
国别省市：