一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了三联灭活疫苗，该灭活疫苗含有灭活的兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌。所述的兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌PmA04，保藏编号为CCTCC NO：M 2021202；所述的兔D型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌PmD01，保藏号为CCTCC NO：M 2021201；所述的兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌SA472，保藏号为CCTCC NO：M 2021200。本发明专利技术的三联灭活疫苗安全性好，疫苗单剂量和超剂量接种试验动物后试验动物健康活泼，无任何局部和全身的不良反应。本发明专利技术的三联灭活疫苗免疫保护性良好，免疫保护期长，能有效地预防兔巴氏杆菌病和兔葡萄球菌病的发生。

【技术实现步骤摘要】
一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术涉及疫苗制备
，具体涉及一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗。
技术介绍
兔巴氏杆菌病和兔葡萄球菌病是兔的常发病和多发病。兔巴氏杆菌病的病原为多杀性巴氏杆菌，该病一年四季均有发生，能危害所有品种和所有日龄的兔，临床上发病兔主要表现为呼吸道症状，有些养兔场该病的发病率甚至高达70%以上。近年来的研究调查发现，我国兔群中多杀性巴氏杆菌的流行情况日趋复杂，由原来的A型多杀性巴氏杆菌为主要流行菌株变为A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌为主要流行菌株。兔葡萄球菌病的病原为金黄色葡萄球菌，该病也常年发生，尤其是高温高湿的季节多发，该病对成年公兔和成年母兔的危害尤为严重，临床上发病兔主要表现为脚皮炎、乳房炎和呼吸道症状，严重地影响着养兔场的正常生产。临床上常见多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌对兔的混合感染，给养兔场的疫病防控带来巨大的挑战。目前，我国市售的兔巴氏杆菌病疫苗仅针对兔A型多杀性巴氏杆菌，可见现有的兔巴氏杆菌病疫苗不能同时有效地预防我国兔群中流行的A型多杀性巴氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌。此外，目前我国还没有市售的商品化兔葡萄球菌病疫苗用于预防兔金黄色葡萄球菌的感染。为解决上述问题，进行一种兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的研制用于预防和控制多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌对兔的感染对保障我国兔产业的发展具有重要的意义。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一是提供一种兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗，所述疫苗含有灭活的兔A型多杀性巴氏杆菌抗原、灭活的兔D型多杀性巴氏杆菌抗原和灭活的兔金黄色葡萄球菌抗原以及佐剂；该三联灭活疫苗对兔群中优势流行的多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的预防和控制效果。所述的兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（pasteurellamultocida）PmA04，该菌是从多例呼吸道病死兔肺脏样品中分离鉴定和筛选出的对兔具有强致病性的A型多杀性巴氏杆菌。将多杀性巴氏杆菌PmA04以1.0×106CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和41.67%（5/12）。该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021202，中国典型培养物保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学。所述的兔D型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）PmD01，该菌是从多例呼吸道病死兔肺脏样品中分离鉴定和筛选出的对兔具有强致病性的D型多杀性巴氏杆菌。将多杀性巴氏杆菌PmD01以1.0×106CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和33.33%（4/12）。该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021201，中国典型培养物保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学。所述的兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）SA472，该菌是从多例葡萄球菌病病死兔的化脓性肺脏样品、乳房炎样品和脚皮炎样品中分离鉴定和筛选出的对兔具有强致病性的金黄色葡萄球菌。将金黄色葡萄球菌SA472以1.0×106CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌株引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和41.67%（5/12）；将金黄色葡萄球菌SA472以1.0×103CFU活菌数经乳导管接种12只哺乳期母兔，观察30天，该菌引起的试验动物发病率和死亡率分别为100%（12/12）和16.67%（2/12）；将金黄色葡萄球菌SA472以1.0×103CFU活菌数经试验兔后脚踏地部皮下接种12只35日龄健康兔，观察30天，该菌引起的试验兔发病率和死亡率分别为100%（12/12）和8.33%（1/12）。该菌已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021200，中国典型培养物保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学。所述的佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDETMGEL02PR佐剂。所述的兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04的抗原含量不低于1.2×1010CFU/mL；所述的兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01的抗原含量不低于1.2×1010CFU/mL；所述的兔金黄色葡萄球菌SA472的抗原含量不低于3.0×1010CFU/mL。所述佐剂在三联灭活疫苗中的体积终浓度为10%。本专利技术的目的之二是提供一种兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1.将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01和兔金黄色葡萄球菌SA472分别接种到脑心浸液培养基，37℃180rpm培养24小时，获得菌液；2.向兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04菌液、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01菌液中分别加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃100rpm灭活24小时；向兔金黄色葡萄球菌SA472菌液中加入体积终浓度为0.3%的甲醛，37℃100rpm灭活24小时；获得三种灭活菌液。3.将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04灭活菌液、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01灭活菌液和兔金黄色葡萄球菌SA472灭活菌液按体积比为1:1:1混合均匀，得到混合菌液；将混合菌液与法国赛比克公司的商品化MONTANIDETMGEL02PR佐剂按体积比为9:1混合均匀，得到三联灭活疫苗，分装后密封，4℃保存。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的三联灭活疫苗制备方法简单，具有良好的免疫保护效果，能同时有效地预防兔A型多杀性巴氏杆菌、兔D型多杀性巴氏杆菌和兔金黄色葡萄球菌对兔的感染。疫苗单剂量和超剂量接种试验动物后试验动物健康活泼，无任何局部和全身的不良反应。本专利技术的三联灭活疫苗免疫保护性良好，免疫保护期长，能有效地预防兔巴氏杆菌病和兔葡萄球菌病的发生。具体实施方式实施例1兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的制备和安全性检测1.兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗的制备将兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04、兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01和兔金黄色葡萄球菌SA472以体积比为0.1%分别接种到500mL脑心浸液培养基（Oxoid公司，货号：CM1135B），37℃180rpm培养24小时，获得菌液。向兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04菌液和兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01菌液中分别加入体积终浓度为0.2%的甲醛，37℃100rpm灭活24小时；向兔金黄色葡萄球菌SA472菌液中加入体积终浓度为0.3%的甲醛，37℃100rpm灭活24小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗含有灭活的兔A型多杀性巴氏杆菌抗原、灭活的兔D型多杀性巴氏杆菌抗原和灭活的兔金黄色葡萄球菌抗原以及佐剂；/n所述的兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种兔A型、D型多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌三联灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗含有灭活的兔A型多杀性巴氏杆菌抗原、灭活的兔D型多杀性巴氏杆菌抗原和灭活的兔金黄色葡萄球菌抗原以及佐剂；
所述的兔A型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（pasteurellamultocida）PmA04，已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021202；
所述的兔D型多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）PmD01，已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021201；
所述的兔金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）SA472，已于2021年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021200；
所述的佐剂为法国赛比克公司的商品化MONTANIDETMGEL02PR佐剂。


2.根据权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的兔A型多杀性巴氏杆菌PmA04的抗原含量不低于1.2×1010CFU/mL；所述的兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01的抗原含量不低于1.2×1010CFU/mL；所述的兔金黄色葡萄球菌SA472的抗原含量不低于3.0×1010CFU/mL。

【专利技术属性】
技术研发人员：王锦祥，谢喜平，孙世坤，陈岩锋，陈冬金，桑雷，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35