一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法。本发明专利技术从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株作为疫苗制备菌株，分别划线接种于TSA固体培养基，TSB培养基上培养，再放大到改进后的发酵罐上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，离心浓缩，再加入佐剂混合乳化制成副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，该疫苗用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
副猪嗜血杆菌病是1906年德国科学家格拉泽发现的，故又称格拉泽氏病。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，在特定条件下如环境改变、其他细菌病毒感染的条件下能够侵入机体的多种组织系统中引起全身症状，临床上以“六炎四水”为病变特征，即胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎、肺炎、脑膜炎，胸腔、腹腔、关节、颅腔积液；临床表现为精神沉郁高热，食欲不振厌食消瘦，关节肿胀跛行，咳嗽呼吸困难，粘膜发绀等症状。该病呈世界性分布，已成为全球范围内危害养猪业的最主要细菌性传染病之一，并已证实在中国绝大多数猪场存在和流行。本病只感染猪，主要是断奶前后仔猪和保育猪，患猪或带菌猪通过空气、接触、消化道传播感染，可影响2周龄～4月龄猪，常见于5-8周龄猪，发病率一般为10％～15％，严重时死亡率可达50％以上。目前国际认可的副嗜血杆菌有15个血清型，其中我国主要以4型和5型最为流行，其次流行血清型主要为12型、13型和14型。目前我国副猪嗜血杆菌病商品化灭活疫苗是以血清型4型和5型制备的二价苗为主。虽然二价疫苗的应用对该病起到了一定的预防作用，但多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果。另一方面，现有疫苗制备方法中，存在以下问题：(1)在菌液发酵罐培养过程中，溶氧量需控制在50％～60％，在培养量为70％时，在生长高峰期耗氧量增大，容易导致溶氧量不足；(2)副猪嗜血杆菌抗原基本上是采用先浓缩再灭活的方式，浓缩过程容易散毒、菌液失活，且在生产过程中菌失活后容易裂解产生内毒素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种发酵罐以及副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，该疫苗用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，具有安全性好、免疫效力高且免疫期长的优点。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术首先提供一种发酵罐，包括罐体，罐体的顶部设有罐口，罐体的顶部连接有进料管，罐体的底部连接有出料管，罐体的侧壁上设有加热夹套，加热夹套上设有进水口和出水口，所述的罐体顶部还设有补料口和进气口，罐体的下部设有取样口，所述罐体内设有搅拌轴和至少一个搅拌桨，所述搅拌轴一端与设置在罐体顶部的驱动电机连接，搅拌轴另一端与搅拌桨连接；所述发酵罐还包括环形通气装置和空气管道，所述空气管道通过从罐体顶部伸入罐体内的下部，空气管道的底部与环形通气装置一端连接，环形通气装置的环形面与罐体底部平行设置。所述环形通气装置由不锈钢管成型。环形通气装置上间隔设有多个不同朝向的通气孔。所述空气管道上设有流量控制器。所述搅拌桨的数量为四个，四个搅拌桨沿搅拌轴长度方向间隔设置。所述罐体的下部还设有温度电极口、溶氧电极口和pH电极口。所述进料管、补料口和出料管上设有过滤网。采用本专利技术发酵罐的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1：生产用种子的制备分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃振荡培养8～10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；S2：制苗用菌液的制备S2-1：菌液培养采用本专利技术发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70～80％加入TSB培养基，同时加入0.01％～0.02％消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，分别加入10％新生牛血清、10～20μg/mLNAD和2％～4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100～150r/min，溶氧值控制在50％-60％，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；S2-2：活菌计数4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；S2-3：灭活浓缩在4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.2～0.4％甲醛溶液，37℃搅拌灭活24～30小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存；分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2～8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；S3半成品检验S3-1纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行检验；S3-2灭活检验灭活结束后，取2支10mLTSB液体培养基，各接种灭活菌液0.2毫升，37℃培养7天；其中，当培养液培养至24小时，分别取0.5ml培养液再移植接种于1支10mLTSB液体培养基，37℃培养24-48小时。观察结果，所有TSB培养基不变浑浊，则视为灭活检验合格。S3-3毒素检验各取4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液0.2ml，经静脉注射18～22gBalb/c小鼠5只，逐日观察3日，小鼠全部健活则视为毒素检验合格；4)疫苗制备将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂(9：1的比例)，搅拌5min～10min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01％的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存；此外，本专利技术乳化佐剂不限，可为油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂等，制备的疫苗可为油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗；5)分装经无菌检验合格后，定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。本专利技术从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株作为疫苗制备菌株，分别划线接种于TSA固体培养基，TSB培养基上培养，再放大到改进后的发酵罐上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，离心浓缩，再加入GEL佐剂混合乳化制成三价疫苗，用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。本专利技术具有以下优点：1、目前我国最为流行的副猪嗜血杆菌血清型是4型、5型、12型，但我国副猪嗜血杆菌病商品化疫苗是以血清型4型和5型制备的二价苗为主，本专利技术提供血清4型、5型、12型有较高的保护力，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的免疫效力。2、采用本专利技术的菌液发酵罐培养时，在发酵罐底部连接有通气装置，可以快速达到溶氧值。发酵罐设置深层通气装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1：生产用种子的制备/n分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；/n用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃ 振荡培养8～10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；/nS 2：制苗用菌液的制备/nS 2-1：菌液培养/n采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70～80％加入TSB培养基，同时加入0.01%～0.02%消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，分别加入10％新生牛血清、10～20μg/mL NAD和2％～4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100～150 r/min，溶氧值控制在50%-60%，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；/nS 2-2：活菌计数/n4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×10...

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：生产用种子的制备
分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；
用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃振荡培养8～10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；
S2：制苗用菌液的制备
S2-1：菌液培养
采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70～80％加入TSB培养基，同时加入0.01%～0.02%消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，分别加入10％新生牛血清、10～20μg/mLNAD和2％～4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100～150r/min，溶氧值控制在50%-60%，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；
S2-2：活菌计数
4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×109CFU/mL；
S2-3：灭活浓缩
在4型H25株、5型H45株、12型H31株的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.2～0.4％甲醛溶液，37℃搅拌灭活24～30小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存；
分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2～8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×1010CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；
S3：半成品检验
上述4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液分别经过纯粹检验、灭活检验、毒素检验，检验结果均合格；
S4：疫苗制备
将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂，搅拌5min～10min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01%的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽萍，张小兰，江兴华，包松英，郑敬敏，叶志海，吴金妃，陈淑亚，温灵燕，黄世潇，蔡艳红，
申请(专利权)人：兆丰华生物科技南京有限公司，兆丰华生物科技福州有限公司，北京科牧丰生物制药有限公司，兆丰华生物科技南京有限公司北京生物医药科技中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32