Thbs1及其抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，公开了Thbs1及其抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术提供了一种以Thbs1为靶点，激活机体免疫发挥抗肿瘤作用的治疗策略。实验证明，通过抑制Thbs1在肿瘤部位的表达，可以促进机体免疫，有效抑制肿瘤生长。通过联合使用Thbs1抑制剂和免疫检查点抑制剂，可以抑制Thbs1蛋白的分泌，从而强化化学免疫治疗，有效抑制肿瘤生长。因此，本发明专利技术公开Thbs1抑制剂可以作为抗肿瘤药物，且可以发挥激活肿瘤免疫治疗的作用，具有重要的应用价值。应用价值。应用价值。

【技术实现步骤摘要】
Thbs1及其抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及以血小板反应蛋白(Thrombospondin
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1，Thbs1)为靶点的药物、抑制剂和治疗方法，及其在抗肿瘤治疗领域内的应用。

技术介绍

[0002]据2019年美国癌症协会的最新报道显示，在过去的十年中，美国女性癌症的发病率稳定，男性的癌症发病率每年下降约2％，而癌症死亡率(2007
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2016年)每年分别下降1.4％和1.8％，这一切无疑归功于各类抗肿瘤疗法的开发和进步。在中国，2018年中国新增癌症病例430万例，新增癌症死亡290万例。与美国和英国相比，中国的癌症发病率较低，但癌症死亡率比英国和美国高30％和40％。并且，由于经济差距导致的可预防性癌症在贫富人群中的差异依然显著。因此，积极开发有效的癌症预防、早期发现和治疗策略，无疑将加速防止癌症的进展，降低癌症的死亡率、延长患者生存期。
[0003]近年来，临床上取得突破性进展的抗肿瘤疗法当属免疫疗法的应用，包括免疫检查点抑制剂、CAR
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T疗法等。但是，其个体差异性、炎症和自身免疫不良反应等限制了免疫疗法的临床应用。因此，寻找新的药物作用靶点和新的抗肿瘤治疗方式依然十分迫切。虽然，诸多临床前研究和发现报道的Thbs1的通过抗血管生成实现抗肿瘤效果，但是尚未发现通过抑制Thbs1的表达，实现免疫治疗肿瘤的报道。总而言之，针对Thbs1的抗肿瘤研究较少，尚未成熟。以Thbs1为靶点的药物和抑制剂未见公开，针对Thbs1蛋白的药物和产品极具发展前景。

技术实现思路

[0004]专利技术目的
[0005]本专利技术的目的是开发一种基于Thbs1蛋白的抗肿瘤策略，扩展肿瘤治疗的手段和方式。本专利技术证明能下调Thbs1的药物和抑制剂等可以有效延长小鼠生存期，促进抗肿瘤免疫等。
[0006]技术方案
[0007]Thbs1及其抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于通过抑制Thbs1蛋白的活性实现抗肿瘤活性。
[0008]所述的应用，其特征在于通过敲减或敲除肿瘤部位Thbs1的表达和分泌、抑制Thbs1基因的功能实现抗肿瘤活性。
[0009]所述的应用，其特征在于以Thbs1蛋白为靶点的抑制剂，包括透明质酸
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冬凌草甲素前药、冬凌草甲素、HNPs、以及干扰RNA序列。
[0010]所述的干扰RNA序列包括siRNA和shRNA；
[0011]注shRNA是根据siRNA设计而成，一般先合成设计siRNA。
[0012]siRNA1序列：GCTGGAAAGATTTCACTGCAT
[0013]shRNA1序列如下：
[0014]Top strand:
[0015]TCGAGGCTGGAAAGATTTCACTGCATTTCAAGAGAATGCAGTGAAATCTTTCCAGCTTTTTTA
[0016]Bottom strand:
[0017]AGCTTAAAAAAGCTGGAAAGATTTCACTGCATTCTCTTGAAATGCAGTGAAATCTTTCCAGCC
[0018]siRNA2序列：GCGCCTATTTACTTCCCACTA
[0019]siRNA2序列：
[0020]Top strand:
[0021]TCGAGGCGCCTATTTACTTCCCACTATTCAAGAGATAGTGGGAAGTAAATAGGCGCTTTTTTA
[0022]Bottom strand:
[0023]AGCTTAAAAAAGCGCCTATTTACTTCCCACTATCTCTTGAATAGTGGGAAGTAAATAGGCGCC
[0024]siRNA3序列：TGAAACCGATTTCCGACAATT
[0025]shRNA3序列如下：
[0026]Top strand:
[0027]TCGAGGTGAAACCGATTTCCGACAATTCTCGAGAATTGTCGGAAATCGGTTTCATTTTTTA
[0028]Bottom strand:
[0029]AGCTTAAAAAATGAAACCGATTTCCGACAATTCTCGAGAATTGTCGGAAATCGGTTTCACC。所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为皮肤黑色素瘤、肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、宫颈鳞癌和腺癌、胆管癌、结肠癌、结直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形成性胶质细胞瘤、胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、混合肾癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓细胞样白血病、脑低级别胶质瘤、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠腺癌、肉瘤、胃癌、食管癌、睾丸癌、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤。
[0030]具体而言：
[0031]本专利技术以各种肿瘤模型为研究对象。设计腺病毒包载shRNA用于敲减Thbs1的表达和活性，进一步的，在黑色素瘤模型小鼠体内采用该腺病毒包载的shRNA敲减小鼠瘤内的Thbs1，研究小鼠的肿瘤生长曲线和淋巴细胞表达。结果表明，敲减Thbs1的小鼠肿瘤生长得到明显抑制，且肿瘤免疫得到激活。其次，体外蛋白质质谱结果表明共组装体系冬凌草甲素
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透明质酸前药/脂质体
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anti
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CTLA
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4(HNPs)可以降低肿瘤细胞Thbs1的分泌和表达(如表1所示)，证明HNPs是Thbs1的一种抑制剂。进一步的，将HNPs经尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内，可以有效抑制肿瘤的生长，促进肿瘤免疫，包括抑制Treg表达，促进CD4+ T细胞、CD8+ T细胞的表达等。进一步的，将在黑色素瘤模型中得出的实验结论在GEPIA(gene expression profiling interactive analysis)数据库中进行验证，在各瘤种内的生存期曲线分析结果表明，与Thbs1高表达组相比，Thbs1低表达的生存期明显延长。
[0032]表1为实施例1中HNPs干预肿瘤细胞表达Thbs1的蛋白质质谱结果；
[0033]附图说明
[0034]图1为实施例1中shRNA在体外细胞实验中对Thbs1表达的干扰结果；
[0035]图2为实施例1中瘤内敲减Thbs1后的小鼠肿瘤生长曲线及肿瘤淋巴细胞表达；其中A为肿瘤体积变化曲线；B为CD3+和CD4+T细胞表达结果；C为CD3+和CD8+T细胞表达结果；D为CD4+、CD25+和Foxp3T细胞表达结果。
[0036]图3为实施例2中采用三种不同的方法敲减Thbs1后的小鼠肿瘤生长曲线及肿瘤淋巴细胞表达，其中，A为肿瘤体积变化曲线；B为CD3+和CD4+T细胞表达结果；C为CD3+和CD8+T细胞表达结果；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Thbs1及其抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于通过抑制Thbs1蛋白的活性实现抗肿瘤活性。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于通过敲减或敲除肿瘤部位Thbs1的表达和分泌、抑制Thbs1基因的功能实现抗肿瘤活性。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于以Thbs1蛋白为靶点的抑制剂，包括透明质酸
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冬凌草甲素前药、冬凌草甲素、HNPs、以及干扰RNA序列。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于干扰RNA序列包括siRNA和shRNA；siRNA1序列：GCTGGAAAGATTTCACTGCATshRNA1序列如下：Top strand:TCGAGGCTGGAAAGATTTCACTGCATTTCAAGAGAATGCAGTGAAATCTTTCCAGCTTTTTTABottom strand:AGCTTAAAAAAGCTGGAAAGATTTCACTGCATTCTCTTGAAATGCAGTGAAATCTTTCCAGCCsiRNA2序列：GCGCCTATTTACTTCCCACTAsiRNA2序列：Top strand:TCGAGGCGCCTATTTACTTCCCACTATTCAAGAGATAGTGGGAAGTAAATAGGCGCTTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：何伟，夏元铮，肖青青，李晓彤，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：