一种GLP-1类似物的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种GLP-1类似物的纯化方法，包括以下步骤：1)采用阴离子交换对GLP-1类似物进行纯化；2)采用反相色谱对1)所得纯化物质进行纯化。第一步纯化时，采用的是更为环保、溶剂成本更低、载量更大的阴离子交换纯化技术，实现了对目标物富集的同时，与反相色谱技术形成了互补，去除了反相纯化时难除的氨基酸缺失杂质，同时降低了成本和环保压力；第二步纯化时，再采用高分辨率的反相纯化技术，去除阴离子交换纯化无法除去的异构体杂质和副反应杂质等，最终得到纯度≥99.0％、单杂≤0.15％的GLP-1类似物。1类似物。1类似物。

【技术实现步骤摘要】
一种GLP-1类似物的纯化方法


[0001]本专利技术属于纯化方法
，具体涉及一种GLP-1类似物的纯化方法。

技术介绍

[0002]胰高血糖素样肽-1，简称GLP-1，是回肠内分泌细胞分泌的一种脑肠肽，是目前2型糖尿病药物作用的重要靶点之一。GLP-1具有抑制胃排空和减少肠胃蠕动的效果，因此有助于饮食控制和减轻体重。由于天然的GLP-1容易被人体内的二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，因此，制药企业开发了多种GLP-1类似物，如索玛鲁肽、利拉鲁肽等。
[0003]由于GLP-1类似物的肽链较长，且可能会经过侧链修饰，因此在化学合成的过程中会产生较多的杂质，如异构体杂质、氨基酸缺失或增加杂质、副反应杂质等。目前对于化学合成的GLP-1类似物，主要是通过两步或以上的反相色谱纯化，才能制备得到纯度≥99.0％、单杂≤0.15％的精肽。例如，专利CN 106749613A采用三步反相纯化、专利CN 108640985A采用两步反相纯化得到索玛鲁肽精肽，专利CN 107903318A和专利CN 109438569A均采用两步反相纯化得到利拉鲁肽精肽。反相色谱固然有很强的分离能力，但同时也伴随着大量有机溶剂的使用和有机废液的产生，其在环境污染、废液回收处理和生产成本等方面并不占优势。
[0004]在本专利技术中，第一步先采用阴离子交换进行纯化，第二步再采用反相色谱进行纯化，可得到纯度≥99.0％、单杂≤0.15％的索玛鲁肽和利拉鲁肽。第一步的阴离子交换纯化，载量大，实现对目标物富集的同时，与第二步的反相纯化形成互补，除去了反相纯化时难除的氨基酸缺失杂质；此外，阴离子交换纯化时无需使用有机溶剂，在降低生产和废液处理成本的同时，也更为环保。第二步再采用高分辨率的反相色谱纯化，最终得到纯度≥99.0％、单杂≤0.15％的索玛鲁肽和利拉鲁肽。

技术实现思路

[0005]为了解决上述
技术介绍
中所提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种GLP-1类似物的纯化方法。在本专利技术中，第一步纯化时，采用的是更为环保、溶剂成本更低、载量更大的阴离子交换纯化技术，实现了对目标物富集的同时，与反相色谱技术形成了互补，去除了反相纯化时难除的氨基酸缺失杂质，同时降低了成本和环保压力；第二步纯化时，再采用高分辨率的反相纯化技术，去除阴离子交换纯化无法除去的异构体杂质和副反应杂质等，最终得到纯度≥99.0％、单杂≤0.15％的索玛鲁肽和利拉鲁肽。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种GLP-1类似物的纯化方法，包括以下步骤：
[0007]1)采用阴离子交换对GLP-1类似物进行纯化；
[0008]2)采用反相色谱对1)所得纯化物质进行纯化。
[0009]进一步地，步骤1)前还包括将GLP-1类似物溶解并过滤。
[0010]进一步地，所述GLP-1类似物溶解所用的溶剂为Tris、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷
酸氢二铵、碳酸氢铵、醋酸铵中的一种，浓度为10～30mM，pH为7～9。
[0011]进一步地，所述GLP-1类似物为索玛鲁肽或利拉鲁肽。
[0012]进一步地，所述阴离子交换纯化采用的是强阴离子交换填料，粒径10～30μm，孔径
[0013]进一步地，所述阴离子交换纯化时，缓冲盐体系为Tris、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、碳酸氢铵、醋酸铵中的一种，浓度为10～30mM，pH为7～9；洗脱时用的盐为NaCl，洗脱梯度为0～1.0M。通常用的是缓冲盐体系对应的酸或碱来调节pH。
[0014]进一步地，所述pH采用盐酸、磷酸、甲酸、醋酸、氢氧化钾、氢氧化钠、氨水中的一种或两种来调节。
[0015]进一步地，所述阴离子交换纯化为：用缓冲盐体系作为平衡液，平衡强阴离子交换柱5个CV；平衡后，上样；上样后，先用平衡液洗脱5个CV，再用平衡液和含1.0M NaCl的平衡液进行线性梯度洗脱，含1.0M NaCl的平衡液的洗脱梯度从0～100％。
[0016]进一步地，所述反相色谱采用的是C8反相填料，粒径10μm，孔径
[0017]进一步地，所述反相色谱纯化的有机相为乙腈，水相为0.05～0.15％(V/V)磷酸，有机相的洗脱梯度为23～51％。
[0018]本专利技术的有益效果为：
[0019](1)第一步用离子交换纯化，载量大于传统的反相纯化，可对目标物进行富集。
[0020](2)第一步用离子交换纯化，不必使用有机溶剂，不产生有机废液，更为环保；使用的是盐类进行洗脱，更为环保，价格更低。
[0021](3)离子交换纯化与反相纯化形成互补，去除部分反相纯化时难除的氨基酸缺失杂质；再经过反相纯化，得到纯度≥99.0％、单杂≤0.15％的精肽。
附图说明
[0022]图1是实施例1中索玛鲁肽精肽色谱图；
[0023]图2是实施例1中索玛鲁肽精肽质谱图；
[0024]图3是实施例2中索玛鲁肽精肽色谱图；
[0025]图4是实施例2中索玛鲁肽精肽质谱图；
[0026]图5是实施例3中索玛鲁肽精肽色谱图；
[0027]图6是实施例3中索玛鲁肽精肽质谱图；
[0028]图7是实施例4中利拉鲁肽精肽色谱图；
[0029]图8是实施例4中利拉鲁肽精肽质谱图；
[0030]图9是实施例5中利拉鲁肽精肽色谱图；
[0031]图10是实施例5中利拉鲁肽精肽质谱图；
[0032]图11是实施例6中利拉鲁肽精肽色谱图；
[0033]图12是实施例6中利拉鲁肽精肽质谱图；
[0034]图13是对比例1中索玛鲁肽精肽色谱图；
[0035]图14是对比例1中索玛鲁肽精肽质谱图；
[0036]图15是对比例2中利拉鲁肽精肽色谱图；
[0037]图16是对比例2中利拉鲁肽精肽质谱图。
具体实施方式
[0038]为了更好地理解本专利技术的内容，下面结合具体实施方法对本
技术实现思路
作进一步说明，但本专利技术的保护内容不局限以下实施例。
[0039]说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
[0040]缩写及英文含义GLP-1胰高血糖素样肽-1DPP-IV二肽基肽酶IVHis组氨酸Aib氨基异丁酸Ala丙氨酸CV柱体积
[0041]实施例1：索玛鲁肽纯化
[0042]样品处理：用20mM、pH＝8.5的Tris缓冲液(HCl调pH)溶解索玛鲁肽粗肽，浓度约为20mg/ml；用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，待纯化。
[0043]第一步纯化：用20mM、pH＝8.5的Tris缓冲液(HCl调pH)作为平衡液A相，用含1.0M NaCl的A相作为B相；100％的A相平衡强阴离子交换柱(10*150mm，15μm，)5个CV；平衡后，上样，上样量为0.5g；上样后，先用100％的A相洗脱5个CV，再用A相和B相进行线性梯度洗脱(B相从0～100％，洗脱50min)，流速为5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GLP-1类似物的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用阴离子交换对GLP-1类似物进行纯化；2)采用反相色谱对1)所得纯化物质进行纯化。2.根据权利要求1所述的GLP-1类似物的纯化方法，其特征在于，步骤1)前还包括将GLP-1类似物溶解并过滤。3.根据权利要求2所述的GLP-1类似物的纯化方法，其特征在于，所述GLP-1类似物溶解所用的溶剂为Tris、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、碳酸氢铵、醋酸铵中的一种，浓度为10～30mM，pH为7～9。4.根据权利要求1-3任一所述的GLP-1类似物的纯化方法，其特征在于，所述GLP-1类似物为索玛鲁肽或利拉鲁肽。5.根据权利要求4所述的GLP-1类似物的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换纯化采用的是强阴离子交换填料，粒径10～30μm，孔径6.根据权利要求5所述的GLP-1类似物的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换纯化时，缓冲盐体系为Tris、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄嘉成，尹传龙，陶安进，余品香，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：