桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1及其引物在检测抗灰霉病能力方面的应用，包括：基因MnSPDS1的核苷酸序列；进一步地本发明专利技术要求保护一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的制备方法、一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的应用、一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的荧光定量检测引物组、一种桑树亚精胺合成酶MnSPDS1、一种检测桑树抗灰霉病能力的方法。本发明专利技术克隆了桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1，并通过逆境胁迫实验初步了解了桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的功能，从而为桑树的抗逆性改良奠定了基础。的抗逆性改良奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
更具体地说，本专利技术涉及桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1在检测抗灰霉病能力方面的应用。

技术介绍

[0002]桑树是重要的经济作物，属于桑科桑属，在我国不同地方均有种植。桑叶不仅用于养蚕，桑树中还含有很多有益成分，如酚类物质、生物碱、多糖等。桑树中的DNJ和多糖都有降血糖的功能。而亚精胺(spermidine，SPD)可以作为信号分子参与植物响应逆境胁迫。在SPD的生物合成中，亚精胺合成酶(spermidine synthase，SPDS)是催化腐胺合成SPD的关键酶。目前为止，还未见有亚精胺能否诱导桑树产生对逆境胁迫抗性的相关研究和报道。另在四川、浙江等蚕区，桑树在春季极易发生灰霉病，对桑叶产质量影响极大，因此如何检测桑树抗灰霉病的能力，是目前急需解决的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0004]本专利技术还有一个目的是提供一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1，其能够筛选出具有抗逆性的桑树幼苗。
[0005]为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1，所述桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术进一步要求保护所述的桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的制备方法，包括以下步骤：
[0007]a、从桑树树叶中提取总RNA；
[0008]b、利用上游引物MnSPDS1
‑
F和下游引物MnSPDS1
‑
R将总RNA反转录获得基因MnSPDS1。
[0009]本专利技术进一步要求保护所述的桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的应用，所述桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1用于检测桑树抗灰霉病的能力。
[0010]本专利技术进一步要求保护桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的荧光定量检测引物组，所述荧光定量检测引物组包括上游引物MnSPDS1
‑
F和下游引物MnSPDS1
‑
R，其序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
[0011]本专利技术进一步要求保护一种桑树亚精胺合成酶MnSPDS1，所述桑树亚精胺合成酶MnSPDS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]本专利技术进一步要求保护一种检测桑树抗灰霉病能力的方法，包括以下步骤：
[0013]将灰霉菌菌丝接种到桑树树叶上，侵染预定时间后取下叶片，得侵染叶片；
[0014]通过侵染叶片提取包括桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的cDNA溶液；
[0015]配制包含cDNA溶液的实时荧光定量PCR反应体系，并置于荧光定量PCR仪中，设置反应程序如下：进行30个循环后控制温度为72℃延伸7min，其中，一个循环为：控制温度为
55℃退火30s，控制温度为72℃延伸2min；循环前先控制温度为95℃进行预变性5min；
[0016]反应完成后得到桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的Ct值；
[0017]配置包括桑树A3基因的实时荧光定量PCR反应体系用作对照，得到对照基因A3的Ct值，得到目的基因桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1和对照基因A3的Ct值，使用2
‑
ΔΔCt
方法计算基因MnSPDS1相对表达量。ΔCt＝(Ct
目的基因
‑
Ct A3
)；ΔΔCt＝(ΔCt
处理
‑
ΔCt
未处理
)。设“2
‑
ΔΔCt对照
＝1”，如果“2
‑
ΔΔCt目的基因
>1”，则基因的表达上调，所检测的桑树植株抗灰霉病能力较强；反之基因的表达下调，所检测的桑树植株抗灰霉病能力较弱。
[0018]优选的是，实时荧光定量PCR反应体系的配制为将2μl的25～50ng/μl的cDNA溶液、10μl的2xSYBR Premix、2μl的浓度为25μM的Rox Reference Dye、1μl的浓度为10μM的MnSPDS1
‑
F、1μl的浓度为10μM的MnSPDS1
‑
R、4μl的ddH2O混合。
[0019]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0020]第一、本专利技术首次克隆了桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1。
[0021]第二、本专利技术首次发现桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1在桑树对抗灰霉菌胁迫过程中起着主要作用。
[0022]第三、本专利技术为桑树的抗逆性研究以及桑树抗逆遗传育种奠定了基础。
[0023]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0024]图1为本专利技术一个技术方案中桑树SPDS基因克隆的电泳检测凝胶图；
[0025]图2为本专利技术另一个技术方案中所MnSPDS蛋白序列比对分析图；
[0026]图3为本专利技术另一个技术方案中桑树与其他物种SPDS的进化分析图；
[0027]图4为本专利技术另一个技术方案中桑树SPDS基因结构示意图；
[0028]图5为本专利技术另一个技术方案中病原菌处理后桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1和桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS2在川桑叶中的的表达模式分析图。
[0029]附图标记具体为：
[0030]图1：M：5000DNA Marker；1：MnSPDS1；2：MnSPDS2；
[0031]图4：4：5'UTR；5：3'UTR；6：转录起始位点；7：AdoMet
‑
MTase结构域。
具体实施方式
[0032]下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0033]桑树亚精胺合成酶核糖体RNA基因的获得
[0034]在桑树园随机采摘桑叶，将表面用无菌水洗净，晾干，在研钵中加入液氮，迅速碾磨成粉末，参照OmniPlant RNA Kit(DNase I)说明书进行RNA的分离纯化，具体步骤如下：
[0035]1、植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μl Buffer RL，涡旋振荡使其充分裂解。
[0036]2、将步骤1所得液体转移至已装入收集管的过滤柱中，12000rpm离心2分钟，将收集管中的液体转移到一个新的离心管中。
[0037]3、在步骤2所得裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀。
[0038]4、将上步得到的溶液转移到已装入收集管的吸附柱中,12000rpm离心15秒，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0039]5、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，1200本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1，其特征在于，所述基因MnSPDS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、从桑树树叶中提取总RNA；b、利用上游引物MnSPDS1
‑
F和下游引物MnSPDS1
‑
R将总RNA反转录获得基因MnSPDS1。3.如权利要求1所述的桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的应用，其特征在于，所述桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1用于检测桑树抗灰霉病的能力。4.一种桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的荧光定量检测引物组，其特征在于，所述荧光定量检测引物组包括上游引物MnSPDS1
‑
F和下游引物MnSPDS1
‑
R，其序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。5.一种桑树亚精胺合成酶MnSPDS1，其特征在于，所述桑树亚精胺合成酶MnSPDS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.一种检测桑树抗灰霉病能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：将灰霉菌菌丝接种到桑树树叶上，侵染预定时间后取下叶片，得侵染叶片；通过侵染叶片提取包括桑树亚精胺合成酶基因MnSPDS1的cDNA溶液；配制包含cDNA溶液的实时荧光定量PCR反应体系，并置于荧光定量PCR仪中，设置反应程序如下：进行30个循环后控制温度为72℃延伸7min，其中，一个循环为：控制温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丹，林强，邱长玉，韦伟，李标，曾燕蓉，李韬，卢德，张朝华，朱光书，唐燕梅，朱方容，崔秋英，
申请(专利权)人：广西壮族自治区蚕业技术推广站，
类型：发明
国别省市：