一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，属于生物医药技术领域，所述衍生物为PAsp[DET‑DBCO(‑ss‑siRNA)&CDM]；本发明专利技术还公开了上述衍生物的制备方法，其步骤包括：通过BLA‑NCA单体的开环聚合，合成PBLA，将DET与PBLA反应得到PAsp（DET），对PAsp（DET）进一步修饰，在其侧链上依次引入磺胺‑DBCO‑NHS和羧二甲基马来酸酐，得到PAsp[DET‑DBCO&CDM]，通过PAsp[DET‑DBCO&CDM]和5'‑氨基siRNA与N3‑PEG3‑NHS的连接物反应，得到目标大分子PAsp[DET‑DBCO(‑ss‑siRNA)&CDM]；本发明专利技术提供了一种降甲状旁腺激素的新途径，实现从源头上阻断合成甲状旁腺激素的基因表达，降甲状旁腺作用效果好；另外，本发明专利技术所合成的衍生物，从作用机制上讲，对电解质也不影响，不会导致高钙、高磷、低钙等，因此可以达到单药有效控制甲状旁腺激素的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物、其制备方法及其应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物、其制备方法及其应用。
技术介绍
继发性甲状旁腺功能亢进(secondaryhyperparathyroidism，SHPT)是慢性肾脏病(chronickidneydisease，CKD)的常见并发症，其突出表现就是高甲状旁腺血症，是CKD患者发生心血管事件与死亡的重要因素。目前SHPT的主要药物为活性维生素D，但容易导致高磷、高钙血症，增加血管钙化风险。钙敏感受体(calciumsensingreceptor，CaSR)激动剂(如目前上市的西那卡塞)也被用于治疗SHPT，主要的不良反应是低钙血症，因此临床上两者经常联合使用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一，就在于提供一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，以解决上述问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，所述衍生物为PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，其具有如下式所示的结构：上述结构式中，15≤x≤17，93≤y≤95。本专利技术的目的之二，在于提供上述的仿透明质酸聚氨基酸衍生物的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤：(1)在引发剂作用下，通过BLA-NCA单体的开环聚合，合成聚β-苄基-L-天冬氨酸，即PBLA；(2)将步骤(1)所得的PBLA溶解于溶剂中得到PBLA溶剂，然后将二乙基甲苯(即DET)在惰性气体环境下添加到PBLA溶剂中，搅拌反应，然后进行后处理，得到聚{N-[N'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}，即PAsp(DET)；(3)将步骤(2)所得的PAsp(DET)进一步修饰，在其侧链上依次引入磺胺-dbco-nhs和羧二甲基马来酸酐，得到PAsp[DET-DBCO&CDM]；(4)将5'-氨基siRNA在缓冲液中与N3-PEG3-NHS混合反应，然后加入步骤(3)所得的PAsp[DET-DBCO&CDM]，透析，即得PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]。作为优选的技术方案：步骤(1)中，所述引发剂为正丁胺，所述溶剂为二甲基甲酰胺(即DMF)，所述惰性气体为氩气。作为优选的技术方案：步骤(2)中，反应温度为4℃，反应时间为24h。作为优选的技术方案：步骤(2)中，所述后处理方法为：将反应混合物倒入乙酸溶液中，并依次用HCl溶液和蒸馏水透析，然后冻干。作为优选的技术方案：步骤(3)中，引入磺胺-DBCO-NHS的具体方法为：将PAsp(DET)溶于缓冲液中得到PAsp(DET)缓冲溶液；将二苯基环辛炔-磺基-琥珀酰亚胺酯(即Sulfo-DBCO-NHS)溶解于溶液中，然后加入到PAsp(DET)缓冲溶液中，搅拌反应，得到磺基DBCO共轭PAsp(DET)溶液。作为优选的技术方案：步骤(3)中，引入羧二甲基马来酸酐的具体方法为：将羧二甲基马来酸酐溶解于溶液中，加入到磺基DBCO共轭PAsp(DET)溶液中，搅拌反应，然后进行后处理，即得。本专利技术的目的之二，在于提供上述的仿透明质酸聚氨基酸衍生物的应用，具体而言，所述衍生物用于降甲状旁腺激素。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术通过合成仿透明质酸聚氨基酸衍生物PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，该大分子物质具有明显的跨细胞膜转运功能，能将甲状旁腺激素mRNA的特异性聚合RNAi转运至细胞内。在溶酶体的作用下，该大分子物质释放出RNAi，沉默细胞内甲状旁腺激素mRNA，从而发挥抑制甲状旁腺激素生成的作用；本专利技术通过阻断甲状旁腺激素mRNA的转录，从而达到有效抑制甲状旁腺激素的合成，目前未见到利用该作用机制发挥疗效的药物；本专利技术提供了一种降甲状旁腺激素的新途径，其优点在于从源头上阻断合成甲状旁腺激素的基因表达，降甲状旁腺作用效果好；本专利技术还通过对该大分子进行修饰，有效解决了跨细胞膜转运的问题，从而高效、精准的发挥作用；另外，本专利技术所合成的大分子，从机制上讲，对电解质也不影响，不会导致高钙、高磷、低钙等，因此可以达到单药有效控制甲状旁腺激素的效果。附图说明图1为本专利技术实施例1合成的PAsp(DET)在D2O中的1H-NMR谱；图2为本专利技术实施例1合成的PAsp[DET-DBCO&CDM]的1H-NMR谱；图3为本专利技术实施例2的基因敲除效率对比图；图4为本专利技术实施例3的细胞活性对比图；图5为本专利技术实施例4的细胞摄取结果图；图6为本专利技术实施例5的抑制甲状旁腺激素功能结果图；图7为本专利技术实施例6的pH和氧化还原响应功能；图8为本专利技术实施例6的基于LDH检测的一类样品对细胞膜的破坏能力的估计；图9为本专利技术实施例6的PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]或透明质酸与晚期核内体和溶酶体的定量共定位。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术作进一步说明。实施例1：一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，所述衍生物为PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，其具有如下式所示的结构：上述结构式中，x+y＝110；x约为16，y约94。本实施例例举上述衍生物的其中一种制备方法，其步骤包括：(1)以正丁胺为引发剂，通过BLA-NCA单体的开环聚合，合成聚β-苄基-L-天冬氨酸(即PBLA)：具体方法为：在氩气环境下，将醋酸酐正丁胺(50.0μL，0.506mmol)溶于二氯甲烷(5.0mL)中，然后将溶液添加到二甲基甲酰胺(即DMF，20.0mL)和二氯甲烷(200mL)混合溶剂中的β-苄基-L-天冬氨酸N-羧酸酐(即BLA-NCA，20.0g，80.2mmol)中，并在35℃搅拌48h；将反应溶液倒入乙醚中以沉淀PBLA；回收的PBLA溶解在二氯甲烷(1.25L)中；二氯甲烷蒸发后，PBLA溶解于苯中，冻干收集得到PBLA(11.93g，产率59％)；然后通过PBLA与二亚乙基三胺(即DETA)的氨解反应将氨基引入PBLA侧链，其反应式如下所示：(2)PAsp(DET)的典型合成过程如下：二乙基甲苯(即DET，13.1mL，121mmol)在氩气环境下添加到二甲基甲酰胺(即DMF，10.0mL)中的PBLA(500mg，24.9μmol)中，并在4℃下搅拌24小时；将反应混合物缓慢地倒入20％v/v乙酸(104mL)中，并依次用0.01NHCl溶液和蒸馏水透析；将最终溶液冻干以获得作为氯化物的聚{N-[N'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}，即PAsp(DET)(461mg，69.3％产率)；所得PAsp(DET)PAsp(DET)在D2O中的1H-NMR谱如图1所示，其侧链上的1,2-二氨基乙烷(PAs本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，其特征在于：所述衍生物为PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，其具有如下式所示的结构：/n

【技术特征摘要】
1.一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物，其特征在于：所述衍生物为PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]，其具有如下式所示的结构：



上述结构式中，15≤x≤17，93≤y≤95。


2.权利要求1所述的仿透明质酸聚氨基酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在引发剂作用下，通过BLA-NCA单体的开环聚合，合成聚β-苄基-L-天冬氨酸，即PBLA；
(2)将步骤(1)所得的PBLA溶解于溶剂中得到PBLA溶剂，然后将二乙基甲苯在惰性气体环境下添加到PBLA溶剂中，搅拌反应，然后进行后处理，得到聚{N-[N'-(2-氨基乙基)-2-氨基乙基]天冬酰胺}，即PAsp(DET)；
(3)将步骤(2)所得的PAsp(DET)进一步修饰，在其侧链上依次引入磺胺-DBCO-NHS和羧二甲基马来酸酐，得到PAsp[DET-DBCO&CDM]；
(4)将5'-氨基siRNA在缓冲液中与N3-PEG3-NHS混合反应，然后加入步骤(3)所得的PAsp[DET-DBCO&CDM]，透析，即得PAsp[DET-DBCO(-ss-siRNA)&CDM]。

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兰，何金选，牟志向，关天俊，
申请(专利权)人：厦门大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：福建;35