一种用于冠状病毒感染活体显像的分子探针及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种根据冠状病毒S蛋白氨基酸序列衍生出的能特异识别新型冠状病毒（包括SARS‑CoV‑2，SARS‑CoV或者MERS‑CoV等）S蛋白的多肽的方法及其应用，所述包括以下：1.具体涉及的多肽具有下列氨基酸序列：SLDQINVTFLDLEYEMKKLEEAIKKLEESYIDLKEL；2.这个多肽在体外能特异识别新冠病毒S蛋白；3.这个多肽能结合荧光标记物包括但不限于Cy5等，能实现细胞水平或活体水平的成像；4.这个多肽能标记NOTA、DOTA等连接物，能结合放射性核素，包括但不限于

【技术实现步骤摘要】
一种用于冠状病毒感染活体显像的分子探针及制备方法
本专利技术涉及生物医药应用
，特别是涉及一种用于冠状病毒感染全身诊断的荧光或者放射性核素标记的分子探针及其制备方法。
技术介绍
2019年开始的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19），造成全球大流行，对社会发展和经济生产构成严重威胁。研究和发展高效的检验方法用于新冠疾病的精准诊断，对防控新型冠状病毒感染和新冠肺炎治疗具有重要的意义。目前新冠肺炎的确诊主要依靠核酸检测，该方法虽特异性强，但因受限于取样部位和方法，故存在假阴性问题（WatsonJ,BMJ,2020;369:m1808.WoloshinS,NEJM,2020;383(6):e38）。根据此次新冠肺炎的临床诊疗经验，肺部影像的异常表现通常早于临床症状，因此影像学检查对于新冠肺炎的诊疗具有不可忽视的地位！国内外最新的诊疗方案均把影像学指标作为新冠肺炎早期筛查和诊断的重要依据(中华人民共和国国家卫生健康委员会，新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）。传统的影像学检查经常会出现与核酸检测结果不一致的情况，严重困扰了临床诊治和疫情防控。开发和应用好功能影像学工具（基于特征靶标的全身活体成像技术），如特异靶向性的PET/CT成像（充分结合功能成像和结构成像两种技术的优势），有望很好地解决临床诊断中影像学和核酸检测不一致的问题。S蛋白（spikeprotein，刺突蛋白）是新冠病毒进入宿主细胞必不可少的核心元件，对病毒介导的细胞进入和膜融合的激活都起极其重要的作用。研究发现，新冠病毒S蛋白上S1亚单位RBD（ReceptorBindingDomain）与人体靶细胞上的ACE2（angiotensinconvertingenzyme2）受体特异性识别后，对病毒与细胞融合起关键作用的S2亚单位暴露出来（YanR,Science,2020;367(6485):1444-1448）。根据最新报道的分子结构，S2亚单位由三聚体单元S2中的七肽重复域（HR1和HR2）相互作用，形成六螺旋束（6-HB）结构的6-聚体，拉近了病毒和细胞的距离，利于病毒-细胞融合而释放RNA到人体细胞内。ShuaiXia等研究发现从冠状病毒S蛋白的HR2区间衍生的多肽可以有效抑制冠状病毒细胞融合的6-聚体形成，并利用这个原理开发出衍生于S2蛋白的HR2多肽，因为这个区间新冠和SARS病毒序列高度保守，这个多肽可以非常高效地抑制新冠病毒的细胞进入过程(XiaS,Cellresearch,2020;30(4):343-355)。根据这些文献报道，我们从SARS-CoV-2中S蛋白上S2亚基相对保守的HR2结构域，合成了这个HR2-36肽（HR-609）。同时，我们对HR-609进行了NOTA，Biotin以及Cy5的修饰，在蛋白、细胞以及活体水平评估此多肽能否在活体识别新冠病毒S蛋白。我们的数据表明这个HR-609不论进行NOTA、Biotin或者Cy5修饰，它们识别S蛋白的特异性都不受影响。因而，通过放射性核素标记HR-609制备具有高亲和力和功能活性的探针，利用核医学技术手段，可以实现新冠病毒感染的全身、无创、精准诊断。目前,国内外尚未有此类型文献和专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于新型冠状病毒感染及全身诊断的荧光或者放射性核素标记的多肽探针及其制备方法。识别新冠S蛋白的多肽，所述多肽包括如下所示的特征序列部分：多肽HR-609：SLDQINVTFLDLEYEMKKLEEAIKKLEESYIDLKEL本专利技术的实验方案：本专利技术提供的用于新冠病毒感染全身诊断的分子探针，是以双功能偶联剂共价连接HR-609，能标记荧光染料或放射性核素等标记物，从而实现诊疗目的。所述的HR-609为多肽分子，其功能是与新冠病毒S蛋白上S2亚单位HR1紧密结合。所述的标记物包括但不限于荧光染料如Cy5等，放射性核素如68Ga，64Cu等。本专利技术还提供了上述放射性核素标记的分子探针的制备方法，含有以下步骤：（1）HR-609与双功能偶联剂共价结合：将HR-609与双功能偶联剂共价连接，得到标记前体NOTA-HR-609；（2）放射性核素标记：应用放射性核素对标记前体进行标记，所述放射性核素选自68Ga或64Cu。所述的共价连接反应是发生在双功能偶联剂的活化羧基与HR-609中糖苷上的伯胺之间。上述方法中，放射性核素为64Cu，制备方法为向含有30-500μg的标记前体NOTA-HR-609溶于100μL的醋酸钠缓冲液（0.1-0.5M，pH=5.5）中（不易溶解的多肽可通过添加少量DMSO或超声助溶），加入65-85MBq的[64Cu]CuCl2（通常以CuCl2的化学形式存在于0.01MHCl中），混合物在室温下反应30-60min（时间一般控制在60min之内）之后完成标记。可以使用HPLC或TLC测定标记率，若标记率大于95%，可无需纯化直接使用。若标记率小于90%时，Sep-pakC18柱分离纯化，得到64Cu-NOTA-HR-609。优选地,室温（RT）下反应60min。所述Sep-pakC18柱分离方法为：将标记后的产物用生理盐水稀释至1-2mL后，用注射器推入活化好的Sep-pakC18柱（分别用注射器吸取10mL无水乙醇、10mL超纯水依次淋洗柱子），先用2mL左右的生理盐水洗去未反应的64Cu离子，之后用少量乙醇将产物冲下，洗脱出目标化合物64Cu-NOTA-HR-609。本专利技术提供了上述分子探针在新冠病毒感染或全身诊断中的应用。本专利技术提供了上述分子探针在正电子发射型计算机断层成像（PET）中的应用。本专利技术还提供了一种用于新冠病毒感染或全身诊断的显像剂,其含有本专利技术所述的放射性核素标记的分子探针。64Cu-HR-609的体外稳定性实验表明,分子探针64Cu-NOTA-HR-609具有良好的稳定性。64Cu-NOTA-HR-609PET显像表明，分子探针64Cu-NOTA-HR-609对新冠病毒感染更具有特异性，可以有效区分新冠病毒感染和炎症组织，有望成为新冠病毒感染早期或全身精准诊断的新型显像剂。本专利技术的优点和积极效果：本专利技术所提供的分子探针能够与新冠病毒S2亚基特异性识别，通过核医学技术手段，精准地对感染组织进行诊断定位；本专利技术采用的间接标记方法，既可减小对HR-609活性的影响，提高感染组织对分子探针的摄取，同时又可增强放射性分子探针的稳定性，在新冠病毒感染或全身诊断方面具有良好的应用前景。附图说明图1体内靶向COVID-19的肽探针的设计策略图。（A）SARS-CoV-2主要通过呼吸道进入人体并引起感染。但是，该病毒可能存在于除肺外的胃肠道，肝脏，肾脏，甚至大脑或其他身体器官中。冠状病毒表面的刺突蛋白，包括融合前刺突（S1/S2复合体）和融合后刺突（S2亚基），可能是体内COVID-19成像的重要目标。我们设计的新型分子探针HR-609可以特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于活体成像特异性识别新型冠状病毒（SARS-CoV-2）刺突（S）蛋白的多肽分子探针，其特征在于：所述多肽的序列中包括特征序列部分。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于活体成像特异性识别新型冠状病毒（SARS-CoV-2）刺突（S）蛋白的多肽分子探针，其特征在于：所述多肽的序列中包括特征序列部分。


2.根据权利要求1所述的特异性识别S蛋白的多肽，所述特征序列部分包括:
多肽HR-609：SLDQINVTFLDLEYEMKKLEEAIKKLEESYIDLKEL。


3.根据权利要求1所述的特异性识别新冠S蛋白的多肽，其特征在于：所述多肽可以特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：单鸿，金红军，冼建忠，李志军，毕蕾，杨帅，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东;44