一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2共同抗原表位肽及其应用，属于生物医学领域。本发明专利技术首次公开了一种SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2共同抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.35所示。本发明专利技术提供的抗原表位肽是具有高度保守性的B细胞线性抗原表位，能够诱导动物产生有效的体液免疫应答，具有较强的免疫原性。本发明专利技术将上述抗原表位肽偶联载体蛋白后，免疫小鼠筛选制备靶向该抗原表位的单克隆抗体，制备的单克隆抗体能够同时识别SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2，具有优秀的亲和力和很高的特异性，稳定性能良好，为SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2的预防、检测、治疗提供了新的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽及其应用
本专利技术涉及生物医学领域，特别是涉及一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽及其应用。
技术介绍
冠状病毒是自然界广泛存在的一大类病毒，其中SARS-CoV和SARS-CoV-2两种冠状病毒均对全球公共卫生造成了巨大威胁。表面棘突糖蛋白(S)是冠状病毒的主要抗原，它通过与宿主受体结合并介导病毒-宿主膜融合，对病毒进入宿主细胞至关重要。SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白的氨基酸序列一致性约为77％，如此高度的序列相似性使得两者之间存在高水平的抗体交叉反应，且增加了存在共同抗原性表位的可能性。鉴于SARS-CoV-2和SARS-CoV这两种病毒在人与人之间都具有高度的传染性，都构成全球风险，且具有高度的序列相似性，鉴定二者的共同抗原表位及制备以共同表位为靶点的单克隆抗体，以建立可以同时检测这两种病毒的广谱检测方法，以及设计更通用的冠状病毒疫苗至关重要，不仅可以用于SARS-CoV-2疫苗的设计，也可用于对未来冠状病毒的流行和大流行进行交叉保护性抗体应答。但是，多项研究指出，大多数针对SARS-CoV的S蛋白及其RBD区域产生的中和抗体对SARS-CoV-2无明显的交叉作用及中和活性(“Potentbindingof2019novelcoronavirusspikeproteinbyaSARScoronavirus-specifichumanmonoclonalantibody,TianXL等”和“Cross-reactiveantibodyresponsebetweenSARS-CoV-2andSARS-COVinfections，LvHB等”)，因此，寻找一种具有良好交叉作用和中和活性的SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽，对冠状病毒的防治具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，提供一种具有良好交叉作用和中和活性的SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：技术方案之一，提供了一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽，所述共同抗原表位肽序列为以下所述序列之一：1)如SEQIDNO.8所示的序列；2)如SEQIDNO.35所示的序列。技术方案之二，提供了一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原，所述抗原由权利要求1所述的抗原表位肽和载体蛋白偶联得到。在一些优选的实施方案中，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白。技术方案之三，提供了所述的共同抗原表位肽或所述的共同抗原在制备SARS-CoV或SARS-CoV-2抗血清或单克隆抗体中的应用。技术方案之四，提供了一种抗含有所述的共同抗原表位肽的共同抗原的抗SARS-CoV或SARS-CoV-2或同时抗SARS-CoV和SARS-CoV-2的单克隆抗体。在一些优选的实施方案中，所述单克隆抗体重链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQIDNO.29-31所示；所述单克隆抗体轻链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQIDNO.32-34所示。技术方案之五，提供了一种所述的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1)免疫原制备：采用所述的任一共同抗原作为免疫原；2)动物免疫：免疫原中加入弗氏完全佐剂，通过背部皮下多点注射的方法，免疫剂量20μg/只，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠；每隔2周用弗氏不完全佐剂与免疫抗原乳化后以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行2次加强免疫；最后一次加强免疫2周后，测定针对SARS-CoV-2的特异性抗体效价，选择效价较高的小鼠，于细胞融合前4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫原，免疫剂量40μg/只对BALB/c小鼠进行超强免疫；3)细胞融合及单克隆抗体制备：聚乙二醇法将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，HAT选择培养基进行筛选；于融合后12天，分别以SARS-CoV-2S蛋白和阳性反应肽段作为包被抗原，通过间接ELISA法初步筛选阳性杂交瘤细胞；得到的阳性杂交瘤细胞培养后进一步通过间接ELISA法筛选，直到获得稳定分泌抗SARS-CoV-2S蛋白和阳性多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；选择经产的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化，即得单克隆抗体。技术方案之六，提供了所述的共同抗原表位肽或所述的共同抗原表位或所述的单克隆抗体在制备防治SARS-CoV或SARS-CoV-2或SARS-CoV和SARS-CoV-2通用的药物中的应用。技术方案之七，提供了所述的共同抗原表位肽或所述的共同抗原表位或所述的单克隆抗体在制备SARS-CoV或SARS-CoV-2或SARS-CoV和SARS-CoV-2通用的疫苗中的应用。技术方案之八，提供了所述的共同抗原表位肽或所述的共同抗原表位或所述的单克隆抗体在制备SARS-CoV或SARS-CoV-2或SARS-CoV和SARS-CoV-2通用的检测试剂或检测试剂盒中的应用。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术提供的SARS-CoV和SARS-CoV-2S蛋白的共同抗原表位为具有高度保守性的B细胞线性抗原表位，能够诱导动物产生有效的体液免疫应答，具有较强的免疫原性，为建立可以同时检测这两种病毒的广谱检测方法，以及设计更通用的冠状病毒疫苗提供关键的抗原决定簇。将上述抗原表位肽偶联载体蛋白后，免疫小鼠筛选制备靶向该抗原表位的单克隆抗体，本专利技术提供的单克隆抗体能够同时识别SARS-CoV和SARS-CoV-2，且能够识别不同的SARS-CoV-2病毒株，具有优秀的亲和力和很高的特异性，稳定性能良好，为进行SARS-CoV和SARS-CoV-2病原学和致病机理的研究以及快速开发出SARS-CoV或SARS-CoV-2的临床检测方法提供关键材料。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为所述阳性反应多肽与抗血清反应；其中S1-S6为基于RBD设计抗原免疫所得猪血清；M1-M6为基于RBD设计抗原免疫所得鼠血清；R405为所述阳性反应肽；NC为非RBD区域多肽，作为阴性对照；图2为加强免疫2周后，小鼠血清效价；R405为所述阳性反应多肽；BSA为阴性对照；图3为所述单克隆抗体反应性的IFA鉴定结果图；12C10为所述单克隆抗体命名；图中，AlexaFluor488为AlexaFluor488标记的羊抗鼠IgG；DAPI为指示细胞核的细胞核染料；图4为所述单抗的Western-blotting鉴定结果图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽，其特征在于，所述共同抗原表位肽序列为以下所述序列之一：/n1)如SEQ ID NO.8所示的序列；/n2)如SEQ ID NO.35所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原表位肽，其特征在于，所述共同抗原表位肽序列为以下所述序列之一：
1)如SEQIDNO.8所示的序列；
2)如SEQIDNO.35所示的序列。


2.一种SARS-CoV和SARS-CoV-2共同抗原，其特征在于，所述抗原由权利要求1所述的抗原表位肽和载体蛋白偶联得到。


3.如权利要求2所述的共同抗原，其特征在于，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白。


4.一种权利要求1所述的共同抗原表位肽或权利要求2-3任一项所述的共同抗原在在制备SARS-CoV或SARS-CoV-2抗血清或单克隆抗体中的应用。


5.一种抗含有权利要求1所述的共同抗原表位肽的共同抗原的抗SARS-CoV或SARS-CoV-2或同时抗SARS-CoV和SARS-CoV-2的单克隆抗体。


6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQIDNO.29-31所示；所述单克隆抗体轻链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQIDNO.32-34所示。


7.一种权利要求5-6任一项所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)免疫原制备：采用权利要求2-3任一项所述的共同抗原作为免疫原；
2)动物免疫：免疫原中加入弗氏完全佐剂，通过背部皮下多点注射的方法，免疫剂量20μg/只，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠；每隔2周用弗氏不完全佐剂与免疫抗原乳化后以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行2次加强免疫；最后一次加强免疫2周后，测定针对SARS-CoV-2的特异性抗体效...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱萍，蒋敏，张改平，丁培阳，刘红亮，陈玉梅，周景明，祁艳华，王彦伟，冯景，
申请(专利权)人：郑州大学，河南中泽生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41