可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用，冠状病毒重组蛋白为缺失至少部分C末端胞浆尾区的冠状病毒Spiker蛋白。本发明专利技术一些实例的冠状病毒重组蛋白，可以有效形成纳米颗粒，结构稳定并具有良好的免疫原性。本发明专利技术一些实例的冠状病毒重组蛋白，表达量高，同时易于纯化。本发明专利技术一些实例的冠状病毒重组蛋白及其纳米颗粒，有望制备成为冠状病毒的检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。

【技术实现步骤摘要】
可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用
本专利技术涉及一种重组蛋白，特别涉及可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用。
技术介绍
冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，引起多种急慢性疾病。根据系统发育树，冠状病毒可分为四个属：α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为四个独立的亚群A、B、C和D群。冠状病毒感染在世界各地极为普遍。到目前为止，大约有15种不同冠状病毒株被发现，能够感染多种哺乳动物和鸟类，有些可使人发病。除了近期爆发的新型冠状病毒SARS-CoV-2，还有HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV等六种冠状病毒可以感染人类，其中SARS-CoV和MERS-CoV感染后比较严重，分别引发重症急性呼吸综合征和中东呼吸综合征。新冠病毒(SARS-CoV-2)有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spikeprotein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membraneprotein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelopeprotein，E蛋白)。其中刺突蛋白S蛋白有两个亚基：S1和S2，受体结合位点(RBD)位于S1亚基上。它以三聚体的形式组成病毒粒子外膜表面的刺突，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合。在感染过程中，S蛋白被宿主蛋白酶(S蛋白一个福林酶酶切位点)切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，并从融合前状态转变为融合后状态。同时S蛋白及其受体结构域RBD主要负责诱导宿主免疫反应和病毒中和抗体，是疫苗设计的关键抗原位点。在疫苗设计时，一般将S蛋白弗林酶酶切位点突变(氨基酸682-685)，将QQ突变为PP(氨基酸986-987)，维持其融合前构象，保持高免疫原性。以RBD蛋白作为抗原研究存在一些问题，尤其是RBD蛋白分子量太小(约33kDa)，虽然容易表达和纯化，但是不够稳定，容易降解，免疫原性偏弱，一般动物/临床评价需要免疫三针，且免疫剂量相对偏高。融合前的S蛋白(PDB:7JJI_A)全长免疫原性较高，但是在表达分泌/定位于细胞膜时，与细胞内的高尔基体等细胞器结合，易以包涵体存在，产量较低。因此在保持高免疫原性的同时，如何提高S蛋白的产量，具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其表达载体和应用。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种冠状病毒重组蛋白，其为缺失C末端胞浆尾区末端21个氨基酸(cytoplasmictail)的冠状病毒Spiker蛋白，记为S-△CT。在一些实例中，所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1。在一些实例中，S-△CT的氨基酸序列如SEQIDNO.：1所示。本专利技术的第二个方面，提供：一种核苷酸序列，其可编码本专利技术第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白。在一些实例中，核苷酸序列根据宿主细胞的不同而进行序列优化。在一些实例中，核苷酸序列如SEQIDNO.：2所示。本专利技术的第三个方面，提供：一种表达冠状病毒重组蛋白的载体，包括骨架载体，所述骨架载体插入有本专利技术第二个方面所述的核苷酸序列。在一些实例中，所述骨架载体选自pFastBacTM-SCUVI、pFastBacTM-Dual载体、pESCURA载体、pVIVO2-mcs载体、pCDNA3.1载体、pBudCE4.1载体或者pET系列载体在一些实例中，载体的宿主细胞为Spodopterafrugiperda草地夜蛾细胞Sf9、粉纹夜蛾细胞Highfive、果蝇s2细胞、酿酒酵母、大肠杆菌或哺乳动物细胞。本专利技术的第四个方面，提供：冠状病毒重组蛋白纳米颗粒，由本专利技术第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白自聚得到。本专利技术的第五个方面，提供：冠状病毒重组蛋白及其纳米颗粒的应用，所述冠状病毒重组蛋白如本专利技术第一个方面所述，所述应用包括制备检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。本专利技术的第六个方面，提供：一种试剂，包括本专利技术第一个方面所述的冠状病毒重组蛋白，或本专利技术第四个方面所述的冠状病毒重组蛋白纳米颗粒。在一些实例中，所述试剂为检测试剂、疫苗、抗原、预防或治疗性药物。本专利技术的有益效果是：本专利技术一些实例的冠状病毒重组蛋白，可以有效形成纳米颗粒，结构稳定并具有良好的免疫原性。本专利技术一些实例的冠状病毒重组蛋白，表达量高，同时易于纯化。本专利技术一些实例的冠状病毒重组蛋白及其纳米颗粒，有望制备成为冠状病毒的检测试剂原料、疫苗、抗体、预防或治疗性药物。附图说明图1是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白氨基酸结构示意图；图2是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白表达WB分析图图3是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白ELISA检测分析图；图4是SARS-CoV-2的S-△21CT和S蛋白纯化样品SDS-PAGE分析图；图5是SARS-CoV-2的S-△21CT蛋白纳米颗粒电镜分析分析图；图6是SARS-CoV-2的S-△21CT蛋白纳米颗粒诱导的总IgG抗体效价分析图，A:针对RBD，B：针对S全长蛋白；图7是SARS-CoV-2S-21△CT蛋白纳米颗粒诱导中和抗体的分析图(假病毒)。具体实施方式核苷酸序列优选根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，以进一步提高其表达量。所述骨架载体可以业内公知的载体，包括但不限于pFastBacTM-SCUVI、pFastBacTM-Dual载体、pESCURA载体、pVIVO2-mcs载体、pCDNA3.1载体、pBudCE4.1载体或者pET系列载体等。载体的宿主细胞可以是业内周知的表达细胞，包括但不限于Spodopterafrugiperda草地夜蛾细胞Sf9、粉纹夜蛾细胞Highfive、果蝇s2细胞、酿酒酵母、大肠杆菌或哺乳动物细胞等。示例性的，表达冠状病毒重组蛋白的方法，包括如下步骤：1)将冠状病毒重组蛋白载体与线性化的重组杆状病毒杆粒共转染Sf-ɑ昆虫细胞，培养后得到包含编码冠状病毒重组蛋白的重组杆状病毒；2)使用包含冠状病毒重组蛋白的重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养至产生足够的冠状病毒重组蛋白；3)收集宿主细胞并使用裂解液裂解细胞；4)去除细胞碎片，得到的清液分别经过强阳离子EMDSO3纯化、外源凝集素亲和介质LentilLectinSepharose4B和分子筛纯化，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冠状病毒重组蛋白，其为缺失C末端胞浆尾区末端21个氨基酸的冠状病毒Spiker蛋白，记为S-△CT。/n

【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒重组蛋白，其为缺失C末端胞浆尾区末端21个氨基酸的冠状病毒Spiker蛋白，记为S-△CT。


2.根据权利要求2所述的冠状病毒重组蛋白，其特征在于：所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1。


3.根据权利要求1所述的冠状病毒重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPQQAQSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGS(SEQIDNO.：1)。


4.一种核苷酸序列，其可编码权利要求1～3任一项所述的冠状病毒重组蛋白。


5.根据权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于：其序列为ATGTTCGTGTTCTTGGTGTTGTTGCCTTTGGTGTCTTCTCAGTGCGTGAACCTGACCACCAGGACCCAGCTGCCCCCTGCCTACACCAACTCCTTCACCCGCGGTGTCTACTACCCCGACAAGGTGTTCCGCTCCTCCGTGCTGCACTCCACTCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCTCCAACGTCACCTGGTTCCACGCTATCCACGTCTCCGGCACTAACGGTACTAAGCGCTTCGACAACCCCGTCCTGCCTTTCAACGACGGTGTGTACTTCGCTTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCCGCGGTTGGATCTTCGGCACCACCCTCGACTCCAAGACTCAGTCACTCCTGATCGTGAACAACGCTACCAACGTGGTGATCAAGGTGTGTGAGTTCCAATTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGTGTGTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAGTCCGAATTCCGCGTGTACTCCAGTGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTCGAAGGAAAGCAGGGTAACTTCAAGAACCTGAGAGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGATGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACACCCATCAACCTCGTCCGCGACCTGCCTCAAGGTTTCTCCGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCTATCGGTATCAACATCACCCGTTTCCAGACCCTGCTCGCCCTGCACCGCTCCTACCTCACCCCTGGTGACTCCTCCTCCGGTTGGACCGCTGGTGCTGCTGCTTACTACGTGGGTTACCTGCAGCCCCGCACCTTCCTCCTCAAGTACAACGAAAACGGTACTATCACCGACGCTGTGGACTGCGCTCTCGACCCTCTGTCCGAAACCAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTCGAAAAGGGTATCTACCAGACCTCCAACTTCCGCGTGCAGCCTACCGAGTCCATCGTGCGTTTCCCCAACATCACCAACCTCTGCCCTTTCGGTGAGGTGTTCAACGCTACCCGCTTCGCTAGCGTGTACGCCTGGAACCGCAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTCCTGTACAACTCCGCTTCCTTCTCCACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTCTGCTTCACCAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAGGTCCGCCAAATCGCTCCTGGTCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭涛，许煜华，冯金，郭伟丽，陈丽云，郑燕萍，王炳彰，刘双标，
申请(专利权)人：广东华南疫苗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44