包含共价结合的抗原的聚合物囊泡以及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及能够引发免疫应答的聚合物囊泡，其包含选自如下的抗原：(a)多肽；(b)碳水化合物；(c)多核苷酸；和(d)(a)和/或(b)和/或(c)的组合；其中所述抗原经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面。本发明专利技术进一步涉及一种用于生产缀合至聚合物囊泡的抗原的方法以及涉及由所述方法生产的聚合物囊泡。本发明专利技术进一步涉及包含本发明专利技术的聚合物囊泡的组合物、暴露于本发明专利技术的聚合物囊泡或组合物的分离的抗原呈递细胞或杂交瘤细胞。本发明专利技术还涉及包含本发明专利技术的聚合物囊泡的疫苗、引发免疫应答的方法或用于治疗、改善、预防或诊断癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，所述方法包括提供本发明专利技术的聚合物囊泡。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含共价结合的抗原的聚合物囊泡以及其制备方法和用途相关申请的交叉引用本申请要求于2018年9月12日提交的欧洲专利申请no.18193946.3的优先权的权益，该申请的内容以引用的方式全文并入本文以用于全部目的。序列表本申请包含计算机可读形式的序列表，其以引用的方式并入本文。
本专利技术涉及能够引发免疫应答的聚合物囊泡(polymersome)，其包含选自如下的抗原：(a)多肽；(b)碳水化合物；(c)多核苷酸；和(d)(a)和/或(b)和/或(c)的组合；其中所述抗原经由共价键缀合(conjugated)至所述聚合物囊泡的外表面。本专利技术进一步涉及一种用于生产缀合至聚合物囊泡的抗原的方法以及涉及由所述方法生产的聚合物囊泡。本专利技术进一步涉及包含本专利技术的聚合物囊泡的组合物、暴露于本专利技术的聚合物囊泡或组合物的分离的抗原呈递细胞或杂交瘤细胞。本专利技术还涉及包含本专利技术的聚合物囊泡的疫苗、引发免疫应答的方法或用于治疗、改善、预防或诊断癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，所述方法包括提供本专利技术的聚合物囊泡。
技术介绍
虽然免疫是一个确立已久的过程，但是不同免疫原或抗原引发的应答水平之间存在差异。例如，膜蛋白形成一类产生低应答水平的抗原，这又意味着需要大量的膜蛋白来产生或引发所需水平的免疫应答。众所周知，膜蛋白很难合成，并且在没有去垢剂的情况下膜蛋白不溶于水。这使得获得足够量的用于免疫的膜蛋白不仅昂贵而且困难。此外，膜蛋白需要适当折叠才能正常发挥其功能。通常，正确折叠的天然膜蛋白的免疫原性比不能以生理相关的方式折叠的膜蛋白的增溶形式的免疫原性要好得多。因此，即使可以使用佐剂来增强此类增溶的抗原的免疫原性，但这也是一种效率低下且没有太多优势的方法(如WO2014/077781A1)。尽管已将转染的细胞和基于脂质的系统用来呈递膜蛋白抗原以增加分离可能在体内有效的抗体的机会，但这些系统通常是不稳定的(如，是氧化敏感的)、繁琐(tedious)且昂贵的。此外，此类膜蛋白抗原目前的技术水平是将无活性的病毒样颗粒用于免疫接种。另一方面，疫苗是预防疾病(主要是感染性疾病)最有效的方法[如，Liu等人，2016]。截至目前，大多数获得许可的疫苗均是由活病毒或灭活的病毒制成的。尽管它们在产生体液应答(抗体介导的应答)以防止病毒增殖和进入细胞方面是有效的，但是此类疫苗的安全性仍然令人担忧。在过去的几十年中，科学进步已经通过使非复制型重组病毒的疫苗载体工程化从而帮助克服了这些问题。同时，将基于蛋白的抗原或亚单位抗原考察作为更安全的选择。然而，此类基于蛋白的疫苗通常会导致(illicit)较差的免疫(体液和细胞应答)。为了改善抗原的免疫原性特性，已经使用了若干种方法。例如，已经广泛研究了将抗原微包封到聚合物中，然而尽管这确实增强了免疫原性，但是抗原的聚集和变性问题仍然未得到解决[如，Hilbert等人，1999]。此外，将佐剂(如水包油乳剂或聚合物乳剂)[如US9636397B2、US2015/0044242A1]与抗原一起使用以引发更明显的体液和细胞应答。尽管取得了这些进步，但它们在摄取和交叉呈递方面的效率较低。为了促进交叉呈递，基于免疫系统在病毒感染期间的可用信息，已经开发了模拟此类特性的病毒样颗粒。合成结构(比如具有包封的抗原的脂质体)是特别有吸引力的。脂质体是由脂质制成的单层自组装结构，并且作为递送媒介，阳离子脂质体更具吸引力和前景，因为它们能被抗原呈递细胞(APC)有效摄取[如，Maji等人，2016]。此外，脂质体允许整合免疫调节剂比如单磷酰基脂质A(MPL)、CpG寡脱氧核苷酸，该免疫调节剂为通过受体刺激免疫细胞的toll样受体(TLR)激动剂。尽管具有此类递送媒介的优势，但限制因素之一是在血清组分存在下的脂质体的稳定性。通过聚PEG化，负载高熔点的脂质，脂质体的稳定性问题得到了一定程度的解决(reduced)，其中一个充分表征的实例是通过用连接脂质的短共价交联稳定多层囊泡而形成的双层间交联多层囊泡(ICMV)[如，Moon等人，2011]。采用纳米圆盘(nanodisc)[如Kuai等人，2017]或pH敏感颗粒[如Luo等人，2017]，其它纳米颗粒结构已实现了成功免疫接种。但是，由于脂质相关载体的不稳定特性，此类策略尚未在临床上成功地证明。因此，仍然需要提供改善抗原的免疫原性特性、有效摄取和稳定地交叉呈递递送媒介和克服或至少缓解上述难题以及具有改善的功能的方法，尤其是它们还能引发免疫应答(如体液免疫应答)，这在治疗和/或预防感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病中特别重要。另一方面，聚合物囊泡可作为脂质体的稳定替代物，并且已经将它们用于整合膜蛋白以引发免疫应答[如，Quer等人，2011，WO2014/077781A1]。蛋白抗原也被包封在聚合物囊泡的经过化学改变的膜中(但是，是对氧化敏感的膜)，以将抗原和佐剂释放到树突状细胞中[如，Stano等人，2013]。在本专利技术的过程中，尤其是为了增强免疫应答并引发强烈的体液应答，将聚合物囊泡用作对免疫系统而言更好的递送载体，所述聚合物囊泡是由两亲性嵌段共聚物制成的，其没有任何已知的特征，具有经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面的抗原(即，不进行任何化学修饰以利于释放)。作为模型抗原，将卵清蛋白(OVA)和流感血凝素(HA)用在此类聚合物囊泡中并证明了与基于如诸如Sigma佐剂系统(SAS)或包封的抗原的免疫刺激分子的方案相比，具有更好的体液免疫应答。因此，如为了向免疫系统呈递经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面的可溶的或增溶的抗原(或其可溶的或增溶的部分)并如在不添加已知佐剂的情况下激发包含强效价的特异性抗体的免疫应答，本专利技术尤其提供本专利技术的聚合物囊泡作为有效摄取和稳定交叉呈递递送媒介，其改善了抗原的免疫原性特性，并提供了基于其的方法。
技术实现思路
本专利技术涉及能够引发免疫应答的聚合物囊泡，其包含选自如下的抗原：(a)多肽；(b)碳水化合物；(c)多核苷酸；和(d)(a)和/或(b)和/或(c)的组合，其中所述抗原经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面。此外，在本专利技术的过程中发现，提供本专利技术的聚合物囊泡(本文也称为“ACM”)允许，例如，经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面的可溶性(或增溶的)抗原产生(比具有或不具有佐剂的游离抗原以及包封的抗原)更强的体液免疫应答。由此，实现了受试者中抗体产生效率的提高。无论是否使用佐剂均可实现这种效率的提高。此外，本专利技术的聚合物囊泡引发CD8(+)T细胞介导的免疫应答的能力使其作为免疫治疗性抗原递送和呈递系统的潜力显著增加。由于经由共价键缀合至本专利技术的聚合物囊泡的外表面的可溶性(如增溶的)抗原具有改善的免疫原性特性，通过使用此类聚合物囊泡和基于其的方法产生的抗体不仅具有更高的产生成功率和对其相应的体外或体内靶标的更高的亲和力，并且当在各种基于溶液的抗体应用中使用时相应地提高了灵敏性，而且能够容易地针对通过使用游离抗原注射的常规方法不能触发抗体产生的困难抗原产生抗体和/或减少这种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够引发免疫应答的聚合物囊泡，其包含：/ni)选自如下的抗原：/na)多肽；/nb)碳水化合物；/nc)多核苷酸；/nd)(a)和/或(b)和/或(c)的组合；/n其中所述抗原经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180912 EP 18193946.31.一种能够引发免疫应答的聚合物囊泡，其包含：
i)选自如下的抗原：
a)多肽；
b)碳水化合物；
c)多核苷酸；
d)(a)和/或(b)和/或(c)的组合；
其中所述抗原经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面。


2.根据权利要求1所述的聚合物囊泡，其中所述共价键包含：i)酰胺部分；和/或ii)仲胺部分；和/或iii)1,2,3-三唑部分，优选地所述1,2,3-三唑部分为1,4-二取代[1,2,3]三唑部分或1,5-二取代[1,2,3]三唑部分；和/或iv)吡唑啉部分，和/或vi)酯部分；和/或vii)氨基甲酸酯和/或碳酸酯部分。


3.根据权利要求2所述的聚合物囊泡，其中通过使所述聚合物囊泡的外表面上存在的反应性基团与所述抗原的反应性基团反应形成将所述抗原缀合至所述聚合物囊泡的外表面的所述共价键。


4.根据权利要求3所述的聚合物囊泡，其中所述共价键选自：i)羧胺键；ii)1,4-二取代[1,2,3]三唑或1,5-二取代[1,2,3]三唑键；iii)取代的吡唑啉键。


5.根据权利要求4所述的聚合物囊泡，其中：i)所述聚合物囊泡的外表面上存在的反应性基团为醛基以及所述抗原的反应性基团为胺基，由此形成羧胺基；或ii)所述聚合物囊泡的外表面上存在的反应性基团为炔基以及所述抗原的反应性基团为叠氮基，由此优选地通过铜或钌催化的叠氮化物-炔烃环加成反应形成1,2,3-三唑基，进一步优选地所述1,2,3-三唑为1,4-二取代的或1,5-二取代的；或iii)所述聚合物囊泡的外表面上存在的反应性基团为甲基丙烯酸酯和/或羟基以及所述抗原的反应性基团为四唑基，由此形成吡唑啉基，优选地，所述吡唑啉基的形成包括腈亚胺中间体。


6.根据权利要求5所述的聚合物囊泡，其中所述羧胺键已进一步与还原剂反应形成仲胺。


7.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中经由连接子部分形成所述共价键。


8.根据权利要求7所述的聚合物囊泡，其中所述连接子部分L为肽连接子或直链或支链的基于烃的连接子。


9.根据权利要求7或8所述的衔接分子，其中所述连接子部分包含1至约550个主链原子、1至约500个主链原子、1至约450个主链原子、1至约350个主链原子、1至约300个主链原子、1至约250个主链原子、1至约200个主链原子、1至约150个主链原子、1至约100个主链原子、1至约50个主链原子、1至约30个主链原子、1至约20个主链原子、1至约15个主链原子、或1至约12个主链原子、或1至约10个主链原子，其中所述主链原子为任选地被选自N、O、P和S的一个或多个杂原子替代的碳原子。


10.根据权利要求7至9中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述连接子部分包含将所述连接子部分整合至所述聚合物囊泡的膜中的膜锚定结构域。


11.根据权利要求10所述的聚合物囊泡，其中所述膜锚定结构域包含脂质。


12.根据权利要求11所述的聚合物囊泡，其中所述脂质为磷脂或糖脂。


13.根据权利要求12所述的聚合物囊泡，其中所述糖脂包括糖磷脂酰肌醇(GPI)。


14.根据权利要求12所述的聚合物囊泡，其中所述磷脂为鞘磷脂或甘油磷脂。


15.根据权利要求12所述的聚合物囊泡，其中所述鞘磷脂包含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺[DSPE]与聚乙二醇(PEG)的缀合物(DSPE-PEG)或基于胆固醇的缀合物。


16.根据权利要求15所述的聚合物囊泡，其中所述DSPE-PEG包含2至约500个氧化乙烯单元。


17.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中在生理条件下所述连接子为不可水解的和/或不可氧化的。


18.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述生理条件的特征在于：温度在约20-40℃的范围内，大气压为1，和pH在约6-8的范围内。


19.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡具有囊泡形态。


20.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述引发的免疫应答包括体液免疫应答和/或细胞免疫应答。


21.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡为氧化稳定的聚合物囊泡。


22.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡的直径大于70nm，优选地所述直径为约100nm至约1μm，或约100nm至约750nm，或约100nm至约500nm，或约125nm至约250nm，约140nm至约240nm，约150nm至约235nm，约170nm至约230nm，或约220nm至约180nm，或约190nm至约210nm。


23.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中在血清组分存在下所述聚合物囊泡是氧化稳定的，优选地，所述氧化稳定为体内、离体或体外氧化稳定。


24.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡在核内体内部是稳定的，优选地，所述稳定为体内、离体或体外稳定。


25.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中与脂质体或纳米颗粒的相应的氧化稳定性相比，所述聚合物囊泡具有改进的氧化稳定性，优选地，所述改进的稳定性为体内、离体或体外改进的稳定性。


26.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够以不依赖于氧化的方式释放所述抗原并触发体液免疫应答，其中，所述释放为体内、离体或体外释放。


27.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述体液免疫应答包含特异性抗体的产生，进一步优选地，所述免疫应答为体内、离体或体外免疫应答。


28.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够增强效应CD4(+)T细胞和/或CD8(+)T细胞的频率，优选地，所述增强为体内、离体或体外增强。


29.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够在核内体内部释放所述抗原，优选地，所述核内体为晚期核内体，进一步优选地，所述释放为体内、离体或体外释放。


30.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原为包括新抗原的自身抗原或非自身抗原。


31.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原选自：
i)多肽，所述多肽与病毒多肽序列具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；优选地，所述病毒多肽序列为流感血凝素或猪流感血凝素；
ii)多肽，所述多肽与细菌多肽序列具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
iii)多肽，所述多肽与哺乳动物或禽类多肽序列具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；优选地，所述哺乳动物或禽类多肽序列为卵清蛋白(OVA)。


32.根据权利要求31所述的聚合物囊泡，其中所述哺乳动物多肽序列选自：人、啮齿类动物、兔和马多肽序列。


33.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡选自阳离子、阴离子和非离子聚合物囊泡。


34.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡具有(由)一种两亲性聚合物(形成)的周向膜或由两种或更多种两亲性聚合物的混合物形成的周向膜。


35.根据权利要求34所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为基本上非免疫原性的或基本上非抗原性的。


36.根据权利要求34或35所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物既非免疫刺激剂也非佐剂。


37.根据权利要求34至36中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物包含二嵌段或三嵌段(A-B-A或A-B-C)共聚物。


38.根据权利要求34至37中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物包含共聚物聚(N-乙烯吡咯烷酮)-b-PLA。


39.根据权利要求34至38中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物包含羧酸、酰胺、胺、烯属烃、二烷基硅氧烷、醚或亚烷基硫化物的至少一个单体单元。


40.根据权利要求34至39中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为选自如下的聚醚嵌段：低聚(氧乙烯)嵌段、聚(氧乙烯)嵌段、低聚(氧丙烯)嵌段、聚(氧丙烯)嵌段、低聚(氧丁烯)嵌段、聚(氧丁烯)嵌段、共聚物聚(2-甲基-2-噁唑啉)-嵌段-聚(二甲基硅氧烷)-嵌段-聚(2-甲基-2-噁唑啉)、甲基丙烯酸酯封端的ABA嵌段共聚物聚(2-甲基-2-噁唑啉)-嵌段-聚(二甲基硅氧烷)-嵌段-聚(2-甲基-2-噁唑啉)(MA-ABA)以及它们的混合物。


41.根据权利要求34至40中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚(丁二烯)-聚(氧化乙烯)(PB-PEO)二嵌段共聚物。


42.根据权利要求41所述的聚合物囊泡，其中所述PB-PEO二嵌段共聚物包含5-50个PB嵌段和5-50个PEO嵌段。


43.根据权利要求34至42中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚(丙交酯)-聚(氧化乙烯)/1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(PLA-PEO/POPC)共聚物，优选地，所述PLA-PEO/POPC具有75:25(如75/25)的PLA-PEO与POPC(如PLA-PEO/POPC)的比率。


44.根据权利要求34至43中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚(己内酯)-聚(氧化乙烯)/1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(PCL-PEO/POPC)共聚物，优选地，所述PCL-PEO/POPC具有75:25(如75/25)的PCL-PEO与POPC(如PCL-PEO/POPC)的比率。


45.根据权利要求34至44中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚丁二烯-聚氧化乙烯(BD)。


46.根据权利要求34至45中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡包含二嵌段共聚物PBD21-PEO14(BD21)、PBD37-PEO14(BD21)和/或三嵌段共聚物PMOXA12-PDMS55-PMOXA12。


47.根据权利要求1至46中任一项所述的聚合物囊泡，其中：i)所述抗原为可溶的或增溶的；和/或ii)所述聚合物囊泡进一步包含包封的抗原。


48.根据权利要求34至47中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两种或更多种两亲性聚合物具有不同的嵌段长度。


49.根据权利要求48所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡包含两种不同的聚丁二烯-聚氧化乙烯(BD)聚合物，例如BD21和BD37或所述聚合物囊泡，或包含PS-PEG嵌段共聚物与其他不同嵌段长度的PS-PIAT或PS-PEG嵌段的混合物。


50.根据权利要求48或49所述的聚合物囊泡，其中所述抗原缀合至具有更长嵌段长度的两亲性聚合物。


51.一种用于生产能够引发免疫应答的聚合物囊泡的方法，所述方法包括：
使选自如下的抗原：
a)多肽；
b)碳水化合物；
c)多核苷酸；
d)(a)和/或(b)和/或(c)的组合；
经由共价键缀合至所述聚合物囊泡的外表面。


52.一种由权利要求51所述的方法生产的具有与外表面缀合的抗原的聚合物囊泡。


53.一种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的聚合物囊泡。


54....

【专利技术属性】
技术研发人员：M·纳兰妮，F·德卡约，T·A·康奈尔，A·K·汗，
申请(专利权)人：ACM生物实验室私人有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG