虹鳟源性成分实时荧光PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种生物制品中虹鳟源性成分实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有虹鳟源性成分；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增虹鳟源性成分的特异性引物对和虹鳟源性成分的特异性探针。本发明专利技术的虹鳟源性成分的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测动物制品中是否含有虹鳟源性成分提供了一种定性检测方法，具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
虹鳟源性成分实时荧光PCR检测方法
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种利用线粒体基因检测动物制品中虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法。
技术介绍
我国三文鱼养殖能力不足，而真正高品质的三文鱼数量有限、价钱高、需求大，大量依靠进口，因此才会出现众多商家和企业盯准三文鱼这块“肥肉”，和消费者玩起“偷换概念”的游戏。真正意义上的三文鱼（特指大西洋鲑，Salmonsalar）是一种冷水鱼类，适宜生活在16至18摄氏度的水中，对水质的要求非常高，在养殖中稍有不慎就会导致死亡。由于成本原因，售价一直居高不下。大西洋鲑主要的物理替代物种为虹鳟（Oncorhynchusmykiss），鲑科大马哈鱼属（太平洋鲑属）的一种鱼类，英文名为rainbowntrout。原产于北美洲北部和太平洋西岸，多数种群终身生活于低温淡水环境中。繁殖期的雄鱼上下颌变得弯曲，体侧从腮部至尾部的彩虹般桃红色纵带也越发艳丽，虹鳟的名字也由此而来。切片生食的虹鳟和大西洋鲑鱼物理性质十分相似，普通老百姓但从外表很难区分。目前，中国三文鱼消费已进入快车道，到2018年我国三文鱼市场需求规模将接近90亿元，市场需求空前巨大，而我国目前现行标准均没有针对虹鳟的物种鉴定方法或试剂盒进行区分，这就导致了严重的技术断层。这一技术断层使得相关食品安全，市场监督监管部门在面对三文鱼相关产品物种鉴定需求时拿不出现行有效的检测技术依据。在面对突然的舆情、巨大的市场需求、价格差异，相关检测技术缺失必将产生严重的食品安全监管漏洞。如何利用技术手段对相关动物源性制品进行生物监测将是业界面临的一个重大挑战。因此迫切需要建立精确、快速、高灵敏的虹鳟特异性检测技术体系对三文鱼相关生物制品进行物种鉴定。在我国海鲜市场，“掺假”问题一直是消费者投诉的焦点和社会关注的热点。一些不法商贩和企业因利益驱使将低成本原料掺入高价肉及肉制品中。这些行为不仅侵害消费者利益，还可能由于掺杂来源不明物种而导致严重生物安全问题，这些未经检验检疫来源不明的替代物种有可能引起严重疫病的传播，不利于维护社会安定和人民身体健康，如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象。为了打击肉类掺假的违法行为，维护消费者权益和生命安全，保障食品产业的健康发展，我们需要制定严格的法律法规来约束生产者和经营者的行为，同时我们需要制订准确、灵敏、简便的检测方法。因此，有必要建立一套特异性好、灵敏度高、操作便捷的动物制品中虹鳟源性成分荧光定量PCR检测鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术首要目的在于提供一种虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，以克服现有技术所存在的难于对虹鳟成分进行检测、容易出现假阳性结果等的不足。本专利技术的第二个目的在于提供一种检测试剂盒以及检测试剂盒的应用。本专利技术的第三个目的在于提供一种动物制品中虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法的引物对和探针。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，该方法包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有虹鳟源性成分；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增虹鳟源性成分的特异性引物对和虹鳟源性成分的特异性探针，所述扩增虹鳟源性成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述虹鳟源性成分的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。根据本专利技术，所述PCR扩增的条件如下：反应体系为25μL：实时荧光PCR试剂(2×)12.5μL，引物各10μM，探针5μM，DNA模板5μL；PCR反应条件：95℃10min；95℃15s,60℃1min；共45个循环。作为本专利技术的第二个方面，一种虹鳟源性成分的检测试剂盒，该检测试剂盒含有以下试剂：（a）扩增虹鳟源性成分的特异性引物对；（b）虹鳟源性成分的特异性探针；其中，所述扩增虹鳟源性成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述虹鳟源性成分的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。进一步的，所述检测试剂盒还包括：（c）标准参照物，用于定性检测样品中的虹鳟源性成分的含量。作为本专利技术的第三个方面，一种所述的检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒用于定性检测食品或饲料中的虹鳟源性成分。作为本专利技术的第四个方面，一种虹鳟源性成分的特异性引物对和探针，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的有益效果是：1、提供了一种来源于线粒体基因的可特异性鉴定虹鳟源性成分的引物对和探针，其特异性良好，对于虹鳟源性成分能够实现特异性扩增，而对于虹鳟以外的其它成分则不能特异性扩增；而且，所述引物对和探针具有良好的再现性、结果稳定可靠。2、利用所述的引物和探针可快速、大批量地检测食品或饲料中是否存在虹鳟源性成分以及定性检测食品或饲料中的虹鳟源性成分的含量，并且所需样品量少，操作简单，灵敏度高。3、荧光定量PCR只需微量的DNA模板即可检测。4、本专利技术的虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，其适用范围广，特别适用于各类食品或饲料中的虹鳟源性成分的检测，因此可以推广应用，对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持，为食品的市场监督部门和检验检疫部门提供了技术支持。附图说明图1为实时荧光PCR引物特异性试验的扩增曲线图。其中，阳性信号为虹鳟，扩增曲线是虹鳟肉DNA标准品。阴性对照、空白对照、提取对照和其它动物源性样品均无特异性扩增曲线。图2为实时荧光PCR灵敏度试验的样本稀释方法示意图。图3为实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。其中，扩增曲线从左到右分别是(W/W)：20ng/μL、2ng/μL、0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002ng/μL、0.0002ng/μL的虹鳟核酸的样品及阴性对照的样品。图4为实施例6虹鳟源性成分混合样本质量百分比检测5%、1%、0.1%的扩增曲线图。图5为实施例7的实时荧光PCR的扩增曲线图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989）中所述的条件或厂商提供的条件进行。本专利技术的实验材料如下：表特异性检测样品列表实施例1引物对和探针的设计1、本专利技术根据NCBI中虹鳟线粒体基因序列，设计了多组虹鳟特异性引物和探针，具体如下：（1）第一组引物对和探针的设计<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；/n第二步，检测扩增产物的荧光信号；/n第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有虹鳟源性成分；/n其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增虹鳟源性成分的特异性引物对和虹鳟源性成分的特异性探针，所述扩增虹鳟源性成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，所述虹鳟源性成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种虹鳟源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
第二步，检测扩增产物的荧光信号；
第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有虹鳟源性成分；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增虹鳟源性成分的特异性引物对和虹鳟源性成分的特异性探针，所述扩增虹鳟源性成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述虹鳟源性成分的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。


2.如权利要求1所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系为25μL：实时荧光PCR试剂(2×)12.5μL，引物各0.3μM，探针0.1μM，DNA模板5μL；
PCR反应条件：95℃10min；95℃15s,60℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡一村，王瑛，潘良文，张强，王强，宋蓉蓉，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海;31