【技术实现步骤摘要】
阳离子神经毒素本申请是中国专利申请201480043806.7的分案申请，原申请的申请日是2014年7月9日，专利技术名称是“阳离子神经毒素”。本专利技术涉及包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，以及这样的工程化的梭菌毒素在医学和治疗中的用途。梭菌属中的细菌产生高度强大的并且特异性的蛋白毒素，它们能够毒害它们被递送之处的神经元和其它细胞。这样的梭菌毒素的例子包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素以及由巴氏梭菌和丁酸梭菌产生的那些神经毒素。在所述的梭菌毒素中有一些是已知最强大的毒素。例如，肉毒杆菌神经毒素对于小鼠的半数致死剂量(LD50)值范围从0.5到5ng/kg,取决于血清型。破伤风梭菌毒素和肉毒杆菌毒素两者都通过抑制受影响的神经元的功能(特别是神经递质的释放)而起作用。虽然肉毒杆菌毒素在神经肌肉连接处起作用并且抑制周围神经系统中胆碱能的传导,但是破伤风梭菌毒素却在中央神经系统中起作用。在自然界,梭菌毒素是以单链多肽形式被合成的，通过一种蛋白酶解切割事件对该多肽进行翻译后的修饰而形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特异性的切割位点(常常被称为活化位点)处,即位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种二链形式成为了所述毒素的活性形式。这两条链被称为重链(H-链)(具有大约100kDa的分子量)和轻链(L-链)(具有大约50kDa的分子量)。所述的H-链包含N-末端易位元件(HN结构域)和C-末端靶向元件(HC结构域)。所述的切割位点位于所述的L-链和所述的易位结...
【技术保护点】
1.工程化的梭菌毒素，其包含位于梭菌毒素H
【技术特征摘要】
20130709 GB 1312317.91.工程化的梭菌毒素，其包含位于梭菌毒素HCN结构域中的1至80个氨基酸修饰，其中所述1至80个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述1至80个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个pI单位，其中所述工程化的梭菌毒素是：
a.具有pI至少为6.6的工程化的肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083或ASP1086；
b.具有pI至少为5.5的工程化的BoNT/B且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN873、ASN874、GLU892、ASP895、ASN906、ASP940、ASN948、GLU949、ASN958、ASN959、ASN979、ASN990、GLU993、ASP994、GLU997、ASN1012、ASN1019、ASP1030、ASP1047、ASP1049、GLU1065或GLU1072；
c.具有pI至少为5.7的工程化的BoNT/C1且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN881、ASP898、GLU916、GLU927、ASN952、ASN964、ASN965、ASN984、GLU985、ASP986、ASP996、ASN1000、GLU1036、ASN1041、ASP1062、ASP1064、GLU1079或ASP1081；
d.具有pI至少为5.7的工程化的梭菌毒素BoNT/D且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN877、ASP893、ASN894、ASN898、ASN920、ASN945、ASN948、GLU957、GLN958、ASN959、ASN968、ASN979、GLU1030、ASP1031、ASP1033、GLU1047、GLU1051、ASN1052或GLU1066；
e.具有pI至少为6.2的工程化的BoNT/E且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN859、ASP860、ASN892、ASP893、ASP904、ASP909、ASN928、ASN932、ASN934、ASN935、GLU936、ASP945、ASN946、ASN947、ASN966、ASN976、ASN979、ASN981、ASP985、GLN1014、ASN1019、ASN1022、ASP1027或ASN1035；
f.具有pI至少为5.8的工程化的BoNT/F且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN879、ASP896、ASN922、ASN923、ASN928、ASN947、ASN950、ASN952、ASN953、GLU954、ASN963、ASN964、ASN965、ASN987、GLN997、ASN1037、ASP1040、ASP1045、ASN1055或ASP1056；
g.具有pI至少为5.4的工程化的BoNT/G且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASP900、ASN909、ASN910、GLU912、ASN913、ASN945、ASN947、GLU956、ASN965、ASP966、ASN986、ASN1001、ASN1038、ASP1040、ASN1046、ASP1057、GLU1073、ASN1075或ASN1090；或
h.具有pI至少为6.0的工程化的破伤风神经毒素(TeNT)且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN893、ASP894、ASP911、ASN919、ASN927、ASN928、GLU929、GLN968、ASN972、GLU973、GLU1010、ASP1018、ASN1079、ASN1080、ASN1081或ASN1097；和
其中所述1至80个氨基酸修饰选自:
i.酸性氨基酸残基被碱性氨基酸残基替换；
ii.酸性氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替换；
iii.不带电荷的氨基酸残基被碱性氨基酸残基替换；
iv.插入碱性氨基酸残基；或
v.缺失酸性的氨基酸残基。
2.产生工程化的梭菌毒素的方法，所述方法包括修饰梭菌毒素的HCN结构域以引入1至80个氨基酸的修饰，从而产生所述工程化的梭菌毒素，
其中所述1至80个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述1至80个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个pI单位，且
其中所述梭菌毒素是肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN886、ASN905、GLN915、ASN918、GLU920、ASN930、ASN954、SER955、GLN991、GLU992、GLN995、ASN1006、ASN1025、ASN1026、ASN1032、ASN1043、ASN1046、ASN1052、ASP1058、HIS1064、ASN1080、GLU1081、GLU1083或ASP1086；或
其中所述梭菌毒素是BoNT/B且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN873、ASN874、GLU892、ASP895、ASN906、ASP940、ASN948、GLU949、ASN958、ASN959、ASN979、ASN990、GLU993、ASP994、GLU997、ASN1012、ASN1019、ASP1030、ASP1047、ASP1049、GLU1065或GLU1072；或
其中所述梭菌毒素是BoNT/C1且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN881、ASP898、GLU916、GLU927、ASN952、ASN964、ASN965、ASN984、GLU985、ASP986、ASP996、ASN1000、GLU1036、ASN1041、ASP1062、ASP1064、GLU1079或ASP1081；或
其中所述梭菌毒素是BoNT/D且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN877、ASP893、ASN894、ASN898、ASN920、ASN945、ASN948、GLU957、GLN958、ASN959、ASN968、ASN979、GLU1030、ASP1031、ASP1033、GLU1047、GLU1051、ASN1052或GLU1066；或
其中所述梭菌毒素是BoNT/E且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN859、ASP860、ASN892、ASP893、ASP904、ASP909、ASN928、ASN932、ASN934、ASN935、GLU936、ASP945、ASN946、ASN947、ASN966、ASN976、ASN979、ASN981、ASP985、GLN1014、ASN1019、ASN1022、ASP1027或ASN1035；或
其中所述梭菌毒素是BoNT/F且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN879、ASP896、ASN922、ASN923、ASN928、ASN947、ASN950、ASN952、ASN953、GLU954、ASN963、ASN964、ASN965、ASN987、GLN997、ASN1037、ASP1040、ASP1045、ASN1055或ASP1056；或
其中所述梭菌毒素是BoNT/G且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASP900、ASN909、ASN910、GLU912、ASN913、ASN945、ASN947、GLU956、ASN965、ASP966、ASN986、ASN1001、ASN1038、ASP1040、ASN1046、ASP1057、GLU1073、ASN1075或ASN1090；或
其中所述梭菌毒素是破伤风神经毒素(TeNT)且所述1至80个氨基酸修饰包含以下一个或多个修饰：ASN893、ASP894、ASP911、ASN919、ASN927、ASN928、GLU929、GLN968、ASN972、GLU973、GLU1010、ASP1018、ASN1079、ASN1080、ASN1081或ASN1097；和
其中所述1至80个氨基酸修饰选自:
i.酸性氨基酸残基被碱性氨基酸残基替换；
ii.酸性氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替换；
iii.不带电荷的氨基酸残基被碱性氨基酸残基替换；
iv.插入碱性氨基酸残基；或
v.缺失酸性的氨基酸残基。
3.增大梭菌毒素的等电点(pI)的方法，所述方法包括修饰梭菌毒素的HC结构域以引入至少一个氨基酸修饰，从而增大梭菌毒素的pI，
其中所述至少一个氨基酸修饰将所述pI增大到一个值，该值比缺乏所述至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个pI单位，且
其中所述至少一个氨基酸修饰是表面暴露的氨基酸残基的修饰。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一个氨基酸修饰选自：
酸性氨基酸残基被碱性氨基酸残基替换；
酸性氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替换；
不带电荷的氨基酸残基被碱性氨基酸残基替换；
插入碱性氨基酸残基；或
缺失酸性的氨基酸残基。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述至少一个氨基酸修饰位于HCN结构域。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述1至80个氨基酸修饰通过以下引入：
a.合成编码包含所述1至80个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素的核酸序列；或
b.提供编码梭菌毒素的DNA序列，并修饰该DNA序列以将所述1至80个氨基酸修饰引入编码的工程化的梭菌毒素中。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述至少一个氨基酸修饰通过以下引入：
a.合成编码包含所述至少一个氨基酸修饰的梭菌毒素的核酸序列；或
b.提供编码梭菌毒素的DNA序列，并修饰该DNA序列以将所述至少一个氨基酸修饰引入编码的梭菌毒素中。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述方法还包括在合适的宿主细胞中表达所述合成的核酸或DNA序列，裂解所述宿主细胞以提供含有梭菌毒素的宿主细胞匀浆，并分离所述梭菌毒素。
9.根据权利要求1、2、6或8中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其中所述工程化的梭菌毒素包含与选自SEQIDNO：4、6或8的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1、2、6、8或9中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其中所述工程化的梭菌毒素包含选自SEQIDNO：4、6或8的氨基酸序列。
11.根据前述权利要求中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其进一步包含位于HCC结构域中的至少一个氨基酸修饰。
12.根据前述权利要求中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其中所述工程化的梭菌毒素是包含以下七个氨基酸修饰的工程化BoNT/A：ASN886、ASN930、SER955、GLN991、ASN1026、ASN1052和GLN1229。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其中所述工程化的梭菌毒素是包含以下七个氨基酸修饰的工程化是包含以下七个氨基酸修饰的工程化BoNT/A：ASN930、ASN954、SER955、GLN991、ASN1026、ASN1052和GLN1229。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其中所述工程化的梭菌毒素是包含以下七个氨基酸修饰的工程化是包含以下七个氨基酸修饰的工程化BoNT/A：ASN930、SER955、GLN991、ASN1025、ASN1026、ASN1052和GLN1229。
15.根据前述权利要求中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其中所述工程化的梭菌毒素具有至少为8的安全比，其中安全比是这样计算的:测定为pg/小鼠的、体重变化-10％所需的毒素的剂量除以测定为pg/小鼠的、DASED50，其中ED50＝产生一个为2的DAS得分所需的剂量。
16.根据前述权利要求中任一项所述的工程化的梭菌毒素或方法，其中所述氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.5个pI单位。
17.根据前...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·B·安德森，G·S·哈克特，S·M·刘，
申请(专利权)人：益普生生物创新有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。