一种具有荧光信号放大功能的三维DNA微球及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种具有荧光信号放大功能的三维DNA微球及其制备方法与应用，属于分析检测领域。一种三维DNA微球与β‑内酰胺酶抗体结合形成Ab‑DNF材料，能特异性识别耐药菌产生的β‑内酰胺酶。本发明专利技术还公开了一种利用上述Ab‑DNF材料构建单分子检测平台的方法，在384孔板上通过三明治夹心免疫反应，使Ab‑DNF材料与抗原结合并被荧光染料染色形成均匀的荧光点。荧光点数与β‑内酰胺酶浓度之间存在线性关系，从而实现对β‑内酰胺酶的定量检测。此方法灵敏度高，特异性好，简便快速，对β‑内酰胺酶的检测线性范围为100aM～1pM，最低检出限为100aM；对β‑内酰胺类耐药菌的检出限为10CFU/mL，检测时间30min，达到了快速检测的要求。

【技术实现步骤摘要】
一种具有荧光信号放大功能的三维DNA微球及其制备方法与应用
本专利技术属于分析检测领域，具体涉及一种具有荧光信号放大功能的三维DNA微球及其制备方法与应用。
技术介绍
单分子检测是生物标志物检测领域的颠覆性技术，其最大特点是具有超高灵敏度，尤其在生命分析中，针对痕量样本或痕量分析物的精准测定方面发挥着不可替代的作用。但是单分子检测技术尚存在一些问题，如器件制造工艺和精度要求较高、设备昂贵、检测条件苛刻以及检测时间较长等，这极大限制了单分子检测在分析检测领域的应用，因此，亟需发展一种简单、低成本、快速的单分子检测技术。近年来，DNA合成材料由于具有高特异性、高稳定性及易于合成等优势，在生物标志物检测方面发展迅速。其中，三维DNA微球(DNANanoflower，DNF)是由滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)产生的长链DNA自组装得到的花状DNA微球。由于荧光核酸染料可以特异性结合DNA，由长链DNA压缩团聚而成的DNF可结合大量染料形成高亮度的微米级荧光斑点，可在显微镜下直接观察计数。DNF表面有大量的寡核苷酸互补配对结合位点，通过与不同的抗体或DNA键合，实现对不同靶标分子的识别，包括小分子、蛋白质和RNA等。因此其可以作为生物分析检测和生物医学研究中重要的信号放大工具，弥补了单分子检测方法的不足。β-内酰胺类耐药菌已被美国疾病控制中心列为具有严重威胁的一类抗性菌，针对此种耐药菌可通过检测其标志物(β-内酰胺酶)实现对抗性细菌的检测。常规的耐药菌检测方法是传统培养法，需要对病菌进行长时间培养，往往需要12～36h才能得出实验结果，较长的培养时间不利于耐药菌及相关疾病的检测和治疗。因此，建立准确、高灵敏、快速的检测方法对于耐药菌的检测和相关疾病的精准治疗至关重要。基于单分子的标志物检测方法可以用于耐药菌的快速检测，无需长时间培养，弥补了传统细菌检测方法的不足，有助于辅助疾病的精准治疗和预后控制。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有的技术问题，利用三维DNA微球(DNF)与β-内酰胺酶抗体(Ab)结合获得对β-内酰胺酶具有特异性识别能力的材料(Ab-DNF)，并提供一种快速检测β-内酰胺类耐药菌的方法。利用上述Ab-DNF建立一种简单的单分子检测方法，通过荧光计数法检测耐药菌产生的β-内酰胺酶。将具有特异性识别功能的Ab-DNF发展成单分子检测平台，可扩大其在生物分析检测及临床诊断中的实用价值。本专利技术为解决上述技术问题，提供了一种具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球，所述具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球具有荧光信号放大的功能，β-内酰胺酶抗体通过连接的可以与三维DNA微球碱基互补配对的DNA单链连接到三维DNA微球表面，形成可以特异性识别β-内酰胺酶的β-内酰胺酶抗体-三维DNA微球；所述三维DNA微球为含有数量为108～109条的如SEQIDNO.6所示的重复单链形成的花状结构微球。进一步地，上述技术方案中，所述三维DNA微球的粒径为1～3μm。进一步地，上述技术方案中，所述可以与三维DNA微球碱基互补配对的DNA单链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供了具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：a、通过RCA反应制备三维DNA微球，所得三维DNA微球的粒径为1～3μm，呈花状结构，含稳定DNA单链及寡核苷酸互补配对结合位点；所得三维DNA微球为颗粒浓度为107～108个/mL，含重复单链数量108～109条的SEQIDNO.6所示的核苷酸序列；b、β-内酰胺酶抗体和三维DNA微球碱基互补配对的SEQIDNO.3所示的DNA单链连接，得Ab-LD；c、加入如SEQIDNO.4所示的封闭DNA将三维DNA微球表面多余寡核苷酸碱基互补配对结合位点封闭，然后将Ab-LD中的DNA单链通过互补配对连接到三维DNA微球表面，形成可以特异性识别β-内酰胺酶的具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球。本专利技术还提供了一种具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球在单分子检测中的应用。进一步地，应用于β-内酰胺类耐药菌中的β-内酰胺酶的检测。进一步地，上述技术方案中，β-内酰胺酶的检测方法，包括如下步骤：(1)对β-内酰胺类耐药菌进行超声裂解，通过离心获得细菌裂解液，并用PBST缓冲液进行稀释；(2)将2～15μg/mL包被缓冲液稀释的β-内酰胺酶抗体加入孔板中进行包被，包被完成后用PBST缓冲液洗涤；(3)采用封闭缓冲液对孔板进行封闭，封闭完成后用PBST缓冲液洗涤；(4)将步骤(1)所得含有β-内酰胺类耐药菌的稀释液、具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球和1×SYBR-Gold染料的PBST缓冲液加入孔板中，孵育后用PBST缓冲液洗涤；(5)采用倒置荧光显微镜对孔板进行荧光成像，然后通过ImageJ软件对荧光斑点计数。建立荧光斑点数-抗原浓度的标准曲线：1)配制已知浓度的β-内酰胺酶标准溶液样品；2)按照上述方法获得该浓度蛋白标准溶液的荧光斑点数；3)依据标准溶液的浓度和荧光斑点的数量建立标准曲线。进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中超声裂解的时间为5～10min，离心的速度为8000～10000rpm/min；所述步骤(2)中的包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，包被的条件为4～5℃孵育12～14h或37～39℃孵育2～2.5h；所述步骤(3)中封闭缓冲液是体积分数为5％～10％的BSA溶液或山羊血清，体积为30～50μL，封闭的条件为37～39℃孵育60～120min；所述步骤(4)中孵育的条件为37～39℃孵育30～60min。进一步地，上述技术方案中，洗涤次数均为至少3次，每次3～5min，PBST缓冲液为含有0.05％～0.1％(v/v)Tween-20的50mM～100mMPBS缓冲液，所用孔板为透明聚苯乙烯方孔平底板。进一步地，上述技术方案中，所述β-内酰胺类耐药菌包括E.coliA、ToxicA、ToxicB、ToxicC。进一步地，上述技术方案中，步骤(2)中β-内酰胺酶抗体与步骤(4)中具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球中的β-内酰胺酶抗体种类相同。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术以制备的Ab-DNF作为识别元件构建单分子检测方法，在孔板上通过三明治夹心免疫反应，使Ab-DNF材料与抗原结合并被荧光染料染色形成均匀的荧光点。通过被测蛋白标志物的浓度与荧光斑点数目呈线性关系，实现对β-内酰胺酶和β-内酰胺类耐药菌的定量检测。该方法特异性高、操作简单、反应快速，可有效实现对临床耐药菌的快速检测，该方法对β-内酰胺酶的检测线性范围为100aM～1pM，最低检出限为100aM，对β-内酰胺酶耐药菌的检出限为10CFU/mL，β-内酰胺酶与Ab-DNF反应时间为30min。附图说明图1为特异性识别目标蛋白样品的Ab-DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球，其特征在于：所述具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球具有荧光信号放大的功能，β-内酰胺酶抗体通过连接的可以与三维DNA微球碱基互补配对的DNA单链连接到三维DNA微球表面，形成可以特异性识别β-内酰胺酶的β-内酰胺酶抗体-三维DNA微球；所述三维DNA微球为含有数量为10

【技术特征摘要】
1.一种具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球，其特征在于：所述具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球具有荧光信号放大的功能，β-内酰胺酶抗体通过连接的可以与三维DNA微球碱基互补配对的DNA单链连接到三维DNA微球表面，形成可以特异性识别β-内酰胺酶的β-内酰胺酶抗体-三维DNA微球；所述三维DNA微球为含有数量为108～109条的如SEQIDNO.6所示的重复单链形成的花状结构微球。


2.根据权利要求1所述的具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球，其特征在于：所述三维DNA微球的粒径为1～3μm。


3.根据权利要求1所述的具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球，其特征在于：所述可以与三维DNA微球碱基互补配对的DNA单链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


4.权利要求1-3中任一项所述的具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、通过RCA反应制备三维DNA微球，所得三维DNA微球的粒径为1～3μm，呈花状结构，含稳定DNA单链及寡核苷酸互补配对结合位点；所得三维DNA微球为颗粒浓度为107～108个/mL，含重复单链数量108～109条的SEQIDNO.6所示的核苷酸序列；
b、β-内酰胺酶抗体和与三维DNA微球碱基互补配对的SEQIDNO.3所示的DNA单链连接，得Ab-LD；
c、加入如SEQIDNO.4所示的封闭DNA将三维DNA微球表面多余寡核苷酸碱基互补配对结合位点封闭，然后将Ab-LD中的DNA单链通过互补配对连接到三维DNA微球表面，形成可以特异性识别β-内酰胺酶的具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球。


5.权利要求1-3中任一项所述的具有β-内酰胺酶抗体的三维DNA微球在单分子检测中的应用。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘猛，马刘畅，张强，石蒙，常洋洋，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21