用于生产大麻素和其它异戊二烯化的化合物的生物合成平台制造技术

提供了可用于异戊二烯化的酶和用于在无细胞系统中生产大麻素、大麻素前体和其它异戊二烯化的化学物质的重组途径以及催化反应的重组微生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产大麻素和其它异戊二烯化的化合物的生物合成平台相关申请的交叉引用本申请要求2018年8月1日提交的美国临时申请系列号62/713,348的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。关于联邦资助的研究的声明本专利技术在美国能源部颁布的授予号DE-FC02-02ER63421和国立卫生研究院颁布的授予号GM008496下在政府支持下完成。政府具有本专利技术的某些权利。序列表本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子地提交，且特此通过引用整体并入。于2019年8月1日创建的所述ASCII副本命名为Sequence_ST25.txt，且是287,021字节大小。
提供了通过使合适的底物与本公开内容的代谢修饰的微生物或酶促制剂接触来生产大麻素和其它异戊二烯化的化学物质和化合物的方法。背景天然化合物的异戊二烯化增加结构多样性，改变生物活性，并增强治疗潜力。异戊二烯化的化合物经常具有低天然丰度或难以分离。一些异戊二烯化的天然产物包括一大类具有经证实的医学特性的生物活性分子。实例包括异戊二烯基-黄酮类化合物、异戊二烯基-芪类化合物和大麻素。大麻素是一大类具有生物活性的植物衍生的天然产物，它们调节人内源性大麻素系统的大麻素受体(CB1和CB2)。大麻素是有前途的药理学试剂，目前正在进行100多项研究其作为止吐药、抗惊厥药、镇痛药和抗抑郁药的治疗益处的临床试验。进一步，三种大麻素疗法已被FDA批准用于治疗化学疗法引起的恶心、MS痉挛状态和与严重癫痫相关的癫痫发作。尽管它们具有治疗潜力，但药用级(>99％)大麻素的生产仍然面临重大技术挑战。印度大麻脂(Cannibis)植物如食用性大麻(marijuana)和工业大麻(hemp)产生高水平的四氢大麻酚酸(THCA)和大麻二酚酸(CBDA)，以及多种较低丰度的大麻素。但是，由于污染性大麻素的高度结构相似性以及每种作物的大麻素组成的变化，即使高度表达的大麻素(如CBDA和THCA)的分离也是有挑战性的。当尝试分离稀有大麻素时，这些问题被放大。此外，当前的印度大麻(cannabis)种植实践带来了严重的环境挑战。结果，对开发用于生产大麻素和大麻素类似物的替代方法存在相当大的兴趣。
技术实现思路
本公开内容提供了一种重组多肽，其包含选自以下的序列：(a)SEQIDNO:30且具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S、V或非天然的氨基酸；(b)SEQIDNO:30，其具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S、V或非天然的氨基酸，和至少一个选自V49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3和/或G286S的其它突变，其中Z1是S、N、T或G，Z2是H、N或G且Z3是N或H；(c)在表1中所示的突变组合中的任一种；(d)(a)、(b)或(c)中的任一种，其包含1-20个保守氨基酸置换且具有NphB异戊二烯基转移酶活性；(e)与SEQIDNO:30具有至少85％、90％、95％、98％或99％同一性且至少具有在(a)、(b)或(c)中列举的突变的序列；(f)从氨基酸21开始在SEQIDNO:1-28或29中列举的序列；和(g)与SEQIDNO:1-28或29中的任一个具有至少99％同一性的任何序列，其中(a)-(g)中的任一项的多肽执行异戊二烯化反应。在一个实施方案中，所述异戊二烯化反应包括从GPP和油橄榄醇酯(Olivetolate)产生CBGA，或从GPP和divarinicacid产生CBGVA，或从2,4-二羟基苯甲酸或其在C6位置具有化学基团的衍生物(参见，例如，式I)产生CBGXA。式I其中‘X’可以是卤素、羟基、氰基、硝基、酯、烷氧基、氨基、巯基、亚磺酰基、磺酰基、亚磺基、磺基、硫氰酰基、异硫氰酰基、硫醛、二羟硼基、硼酸酯、磷酸酯、醛、羧基、羧酰氨基、叠氮基、氰酰、异氰酰、任选地被取代的(C1-C10)烷基、任选地被取代的(C2-C10)烯基、任选地被取代的(C2-C10)炔基、任选地被取代的(C1-C10)杂烷基、任选地被取代的(C2-C10)杂烯基、任选地被取代的(C2-C10)杂炔基、任选地被取代的(C3-C10)环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂环。在一个实施方案中，X是被取代的或未被取代的含有2-10个碳的烷基。本公开内容也提供了包含多肽的重组途径，所述多肽具有选自以下的序列：(a)SEQIDNO:30且具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S、V或非天然的氨基酸；(b)SEQIDNO:30，其具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S、V或非天然的氨基酸，和至少一个选自V49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3和/或G286S的其它突变，其中Z1是S、N、T或G，Z2是H、N或G且Z3是N或H；(c)在表1中所示的突变组合中的任一种；(d)(i)、(ii)或(iii)中的任一种，其包含1-20个保守氨基酸置换且具有NphB活性；(e)与SEQIDNO:30具有至少85％、90％、95％、98％或99％同一性且至少具有在(i)、(ii)或(iii)中列举的突变的序列；(f)从氨基酸21开始在SEQIDNO:1-28或29中列举的序列；和(g)与SEQIDNO:1-28或29中的任一个具有至少99％同一性的任何序列，和多种将葡萄糖转化为香叶基焦磷酸酯的酶；和(h)与SEQIDNO:1-28或29中的任一个具有至少99％同一性的任何序列，和多种将(异)戊二烯醇转化为香叶基焦磷酸酯的酶。在另一个实施方案中，所述方法还包括丙酮酸脱氢酶旁路酶途径，其包含丙酮酸氧化酶和乙酰基磷酸转移酶。在另一个或其它实施方案中，所述途径包含再循环NADH/NAD和NADPH/NADP的“净化阀”。在前述任一个的另一个或其它实施方案中，所述途径包含以下酶:(i)己糖激酶(Hex)；(ii)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)；(iii)磷酸果糖激酶(Pfk)；(iv)果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(Fba)；(v)磷酸丙糖异构酶(Tpi)；(vi)Gald-3-P脱氢酶(Gap)；(vii)突变体Gald-3-P脱氢酶(mGap)；(viii)NADH氧化酶(Nox)；(ix)磷酸甘油酸激酶(Pgk)；(x)磷酸甘油酸酯变位酶(2,3BPG依赖性的)(dPgm)；(xi)烯醇化酶(eno)；(xii)丙酮酸激酶(FBP依赖性的)；(xiii)丙酮酸氧化酶(PyOx)；(xiv)乙酰基磷酸转移酶(PTA)；(xv)乙酰辅酶A乙酰基转移酶(PhaA)；(xvi)HMG-CoA合酶(HMGS)；(xvii)HMG-CoA还原酶(HMGR)；(xviii)甲羟戊酸激酶(MVK)；(xix)磷酸甲羟戊酸激酶(PMVK)；(xx)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MDC)；(xxi)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)；(xxii)香叶基-PP合酶(GPPS)；和；(xxiii)突变体芳族异戊二烯基转移酶。在任一个前述实施方案的另一个实施方案中，除了磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)和异戊烯基-磷酸激酶(IPK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组多肽，其包含选自以下的序列：/n(a)SEQ ID NO:30且具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S或V；/n(b)SEQ ID NO:30，其具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S或V，和至少一个选自V49Z

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180801 US 62/7133481.一种重组多肽，其包含选自以下的序列：
(a)SEQIDNO:30且具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S或V；
(b)SEQIDNO:30，其具有至少Y288X突变，其中X是A、N、S或V，和至少一个选自V49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3和/或G286S的其它突变，其中Z1是S、N、T或G，Z2是H、N或G且Z3是N或H；
(c)(a)或(b)中的任一个，其进一步包含1-20个保守氨基酸置换且具有NphB活性；
(d)与SEQIDNO:30具有至少85％、90％、95％、98％或99％同一性且至少具有在(a)或(b)中列举的突变的序列；
(e)从氨基酸21开始在SEQIDNO:1-28或29中列举的序列；和
(f)与(e)的序列具有至少85-99％同一性且具有NphB活性的序列，
其中(a)-(f)中的任一个的多肽可以用于执行异戊二烯化反应。


2.权利要求1的重组多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:30且具有选自以下的突变：
(i)V288A；
(ii)Y288N；
(iii)Y288N和F213H；
(iv)Y288A和F213N；
(v)Y288N和V49S；
(vi)Y288S和V49N；
(vii)Y288A和V49S；
(viii)Y288N和G286S；
(ix)Y288N、F213N和V49G；
(x)Y288A、F213N和I234T；
(xi)Y288S、F213N和V49N；
(xii)Y288A、F213N和A232S；
(xiii)Y288N、F213G和V49T；
(xiv)Y288N、F213N、V49S和V271N；
(xv)Y288N、F213G、V49T和V271H；
(xvi)Y288A和G286S；
(xvii)Y288A、G286S和A232S；
(xviii)Y288A、G286S、A232S和F213H；
(xix)Y288V和G286S；
(xx)Y288A和A232S；和
(xxi)Y288V和A232S。


3.权利要求1的重组多肽，所述重组多肽具有SEQIDNO:30的序列且具有Y288A和G286S突变。


4.权利要求1的重组多肽，其中所述异戊二烯化反应包括从GPP和油橄榄醇酯产生CBGA，或从GPP和divirinicacid产生CBGVA，或从GPP和2,4-二羟基苯甲酸或其衍生物产生CBGXA。


5.重组途径，其包含权利要求1的多肽和多种将葡萄糖转化为香叶基焦磷酸酯(GPP)的酶。


6.权利要求5的重组途径，所述重组途径进一步包含含有丙酮酸氧化酶和乙酰基磷酸转移酶的丙酮酸脱氢酶旁路酶途径。


7.权利要求4或6的重组途径，其中所述途径包含再循环NADH/NAD的“净化阀”。


8.权利要求5-7中的任一项的重组途径，其中所述途径包含以下酶：
(i)己糖激酶(Hex)；
(ii)葡萄糖-6-磷酸异构酶(Pgi)；
(iii)磷酸果糖激酶(Pfk)；
(iv)果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(Fba)；
(v)磷酸丙糖异构酶(Tpi)；
(vi)Gald-3-P脱氢酶(Gap)；
(vii)突变体Gald-3-P脱氢酶(mGap)；
(viii)NADH氧化酶(Nox)
(ix)磷酸甘油酸激酶(Pgk)
(x)磷酸甘油酸酯变位酶(2,3BPG依赖性的或Mn2+依赖性的)(dPgm或iPgm)；
(xi)烯醇化酶(eno)；
(xii)丙酮酸激酶(FBP依赖性的/pykF或AMP依赖性的/pykA)；
(xiii)丙酮酸氧化酶(PyOx)；
(xiv)乙酰基磷酸转移酶(PTA)；
(xv)乙酰辅酶A乙酰基转移酶(PhaA)；
(xvi)HMG-CoA合酶(HMGS)；
(xvii)HMG-CoA还原酶(HMGR)；
(xviii)甲羟戊酸激酶(MVK)；
(xix)磷酸甲羟戊酸激酶(PMVK)；
(xx)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MDC)；
(xxi)香叶基-PP合酶(GPPS)或法呢基-PP合酶突变体S82F；和
(xxii)突变体芳族异戊二烯基转移酶。


9.权利要求5-8中的任一项的重组途径，其中给所述途径补充ATP和油橄榄醇酯且所述途径产生大麻素前体。


10.权利要求9的重组途径，其中所述途径进一步包含大麻二酚酸合酶。


11.权利要求10的重组途径，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·U·鲍伊，M·瓦莱瑞，T·P·科尔曼，N·伍道尔，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US