一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途。具体来说，本发明专利技术的肌酸激酶同工酶检测试剂盒中含有样品稀释液，其中，所述稀释液包括：pH7.2‑8.5的缓冲液、离子螯合剂和保护剂。本发明专利技术中最终使得肌酸激酶同工酶校准品的复溶稳定性长，保护期长，储存，运输稳定。与此同时，本发明专利技术涉及的检测试剂盒具有更优的灵敏度和特异性，在节约成本的同时，降低了抗体对于肌酸激酶同工酶的非特异性结合，提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合能够在不加入其它催化剂的前提下快速检测低浓度的肌酸激酶同工酶，可用于心肌梗死的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途
本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途。
技术介绍
2007年10月，由欧洲心脏病学会(ESC)、美国心脏病学会(ACC)、美国心脏学会(AHA)和世界心脏联盟(WHF)全球心肌梗死的统一定义，将急性心肌梗死(AMI)定义为由于心肌缺血导致心肌细胞死亡，此定义在新版中没有变化。AMI是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种严重病症，发病凶险、死亡率高，治疗的最佳时间为发病后120分钟内，因此，临床快速检测对诊断和控制AMI病情颇为关键。现代医学研究表明，可以通过联合检测心肌早期标志物(MYO)、确定标志物(cTnI)和损伤标志物(CK-MB)，来提高临床对AMI诊断的早期性、快速性和正确性。肌酸激酶同工酶(Creatinekinase-MB，CK-MB)的检测可用于急性心肌梗死(AMI)的诊断和预后，心肌炎诊断和预后，肌肉疾病的诊断，脑疾病如脑梗死、脑膜炎、脑炎等疾病的诊断等。肌酸激酶(Creatinekinase，CK)旧称为肌酸磷酸激酶(Creatinephosphokinase，CPK)。CK分子量为81000，由两个亚基组成。通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。CK在ATP参与下催化肌酸磷酸化，生成ATP和磷酸肌酸。这种酶催化反应是可逆的。1979年首次发现前列腺癌患者血清中肌酸激酶的含量显著升高，此后在其他类型的癌症患者中也有相同的发现。随着研究的深入，近年来人们开始通过筛选肌酸激酶抑制剂寻找新的抗肿瘤药物。正是由于肌酸激酶具有的重要的生理功能，更加引起了人们的广泛的注意和深入的研究。肌酸激酶同工酶(CK-MB)二聚体的每个亚基的N末端均有一个小结构域通过连接序列连接到C-末端的一个大结构域上。整个二聚体中，98％的酪氨酸残基被包裹在空间结构内部，仅有2％暴露在结构表面；另外，每个亚基表面均包含2个可以反应的组氨酸残基和2个可以反应的巯基。其复杂的空间结构给体外重组技术的应用带来了很大困难。因此重组难度高，目前市面上高品质的CK-MB均为血源型。但因来源受限价格昂贵，严重阻碍CK-MB诊断产品的研究开发。虽然国内外关于CK-MB相关的报道很多，但多数研究属于学术性研究，主要关注该蛋白酶的结构、功能；而真正关于其产品应用的研究很少。2001年，YoshikoSunahara等同时表达MB、MM、BB三种同工酶，分别纯化后按50:40:10的比例混合处理，运用蛋白动力学原理，完成MB的后期折叠，得到了CK活性较高的蛋白。但该研究就此结束，没有对该蛋白的稳定性、特异性、灵敏度及作为生物原材料的应用做任何研究。另外该研究中，MB的表达及混合比例复杂，工艺稳定性难以控制，不可能用于产品化生产。HuangY等(2006)选择体外表达其同工酶MM，但MM或者BB同工酶的空间结构和MB迥然不同，与MB的天然结构更是相差甚远，不可能代替CK-MB作为临床检测的校准质控品。肌酸激酶同工酶由于是一种生物大分子蛋白质，并且以二聚体的形态存在的，因此，极其不稳定，其苛刻的储存，运输，使用条件等给蛋白的使用带来诸多不便。市场上大多数公司试剂盒的校准品均是以冻干品的形式保存的，低温冻干是目前用于蛋白质，微生物等生物制品干燥保存的一种最有效，最常用的方法。目前，常用的重组蛋白冻干保护剂包括糖类及聚合物，多元醇，无表面活性剂，水溶性氨基酸以及某些盐和胺等，但是稳定性都不足够好。目前，肌酸激酶同工酶的免疫检测方法有多种，其中包括放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(ICA)以及近年来逐渐被广泛适用的化学发光法(CLIA)等。放射性同位素免疫分析法(RIA)的检测原理，将同位素标记的抗原与待测的未标记的抗原分别与不足量的特异性抗体竞争性的结合反应后，通过测量反应的放射性，获得待测抗原的量。该法是80年代以来被日益广泛应用的超微量分析技术。酶联免疫吸附法(ELISA)检测原理，以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。胶体金免疫层析法作为POCT检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，仍以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原-抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，并产生一个色带，而被检测到的免疫检测法。化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统和化学发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质，如吖啶酯等，经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应系统是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原-抗体复合物进行检测。该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。直接化学发光免疫分析是指用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，在氧化剂(H2O2)和NaOH的作用下，吖啶酯便可分解、发光，无需催化剂。强烈的直接发光在一秒内完成，为快速的闪烁发光，发光强度同待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。目前，市面上虽然存在检测肌酸激酶同工酶的化学发光法试剂盒，但是，其中很多试剂盒存在着灵敏度不足、特异性不高等缺点。与此同时，校准品在稳定性不够好，在液体环境中不稳定，容易水解，不利于长期保存。例如，CN102435738A、CN107389941A、CN109490549A、CN109613242A均公开了一种通过化学发光方法对肌酸激酶同工酶进行检测的试剂盒。但是，前述文献中公开的肌酸激酶同工酶试剂盒的校准品的稳定性都不足够好。放射性同位素免疫分析法(RIA)具有操作繁琐、耗时长、结果重复性差、灵敏度和特异性差等问题，且存在放射污染的危险，不适用于大批量检测，现已基本不使用。酶联免疫吸附法(ELISA)，则存在着操作繁琐、灵敏度低、线性范围窄和检测周期长等缺点。而早期AMI发作时，其血清中肌酸激酶同工酶的含量往往很低，由于灵敏度低和检测周期长，该法无法快速准确的检测出早期AMI，这也进一步限制了ELISA在心肌检测中的使用。胶体金免疫层析法作为POCT检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。但由于该法的灵敏度差，进一步限制了其在肌酸激酶同工酶临床检测上的应用。酶促化学发光法是辣根过氧化物酶系统和碱性磷酸酶系统。具有激发发光时间长，测试速度慢，酶易受环境温度的影响等缺点，试剂的稳定性不如直接化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肌酸激酶同工酶样品稀释液，其中，所述稀释液包括：pH7.2-8.5的缓冲液、离子螯合剂和保护剂，其中，/n所述保护剂包含选自由牛血清白蛋白、Casein、复合酶保护剂AFP和复合酶保护剂HPD所组成的组中的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种肌酸激酶同工酶样品稀释液，其中，所述稀释液包括：pH7.2-8.5的缓冲液、离子螯合剂和保护剂，其中，
所述保护剂包含选自由牛血清白蛋白、Casein、复合酶保护剂AFP和复合酶保护剂HPD所组成的组中的一种或多种。


2.根据权利要求1所述的稀释液，其中，所述缓冲液为MOPSO缓冲液；优选的，所述MOPSO缓冲液的pH值为7.2。


3.根据权利要求1-2任一项所述的稀释液，其中，所述保护剂选自牛血清白蛋白、复合酶保护剂AFP和复合酶保护剂HPD，所述离子螯合剂为EDTA；其中，
所述牛血清白蛋白的含量为1％-10％，优选为2-5％，更优选为3％；
所述复合酶保护剂AFP的含量为3-10％，优选为5％；
所述复合酶保护剂HPD的含量为3-10％，优选为5％；
所述EDTA的浓度为5-15mM，优选为10mM。


4.根据权利要求1-3任一项所述的稀释液，其中，所述样品为校准品；优选的，所述校准品为冻干校准品。


5.一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一抗体、标记有示踪标记物的第二抗体和如权利要求1-4任一项所述的肌酸激酶同工酶样品稀释液；其中，
所述第一抗体和所述第二抗体所识别的肌酸激酶同工酶的特异性结合位点不同；
任选的，所述检测试剂盒还包含校准品。


6.根据权利要求5所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其中，所述第一抗体为CKMB-BB，所述第二抗体为CKMB-04；优选的，所述磁性微球和第一抗体的质量比为100:0.5-1.25，所述示踪标记物和第二抗体的质量比为15-40:1。

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞，刘一凡，石晓强，徐建新，李福刚，
申请(专利权)人：上海奥普生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31