促进成骨细胞增殖的小肽制造技术

本发明专利技术提供一种促进成骨细胞增殖的小肽，属于食品加工技术领域。一种对成骨细胞具有促增殖活性的小肽，氨基酸序列如下：GQTPLFPR。本发明专利技术小肽来源于大豆蛋白，安全性好，具有显著的促进成骨细胞增殖的作用，且能够显著可以显著促进成骨细胞的分化，因此有望用于制备促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松的药物或功能食品。本发明专利技术小肽合成方便，可工业化生产，在食品、医药及化妆品等领域具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
促进成骨细胞增殖的小肽
本专利技术涉及促进成骨细胞增殖的小肽,属于食品加工

技术介绍
骨质疏松症是以骨量减少、骨组织退化及微结构破坏导致骨强度和韧度降低为特征的一种代谢性疾病，其发病率较高，尤其是随着老龄化时代的到来，骨质疏松及其并发症如骨折等日益成为一项危害大众身体健康的社会问题。目前治疗骨质疏松的药物以作用于破骨细胞的骨吸收为主，而靶向于成骨细胞增殖促进骨形成的药物较少，且目前市场上抗骨质疏松药物如双膦酸盐，选择性雌激素受体调节剂和降钙素等普遍存在严重的副作用。因此开发高效、安全、副作用小的抗骨质疏松的天然产物成分日益受到关注。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对成骨细胞具有促增殖活性的小肽。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种对成骨细胞具有促增殖活性的小肽，具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术还提供所述小肽的修饰肽，对手术小肽进行修饰，在所述小肽的N端、C端或中间残基上连接氨基酸、多肽、蛋白质或PEG。在本专利技术中，对所述小肽的修饰包括：对所述小肽的N端进行甲酰化或乙酰化，或者在N端连接脂肪酸、肼基烟酰胺、二乙烯三胺五乙酸、肉豆蔻酸、十六酸或琥珀酰胺或PEG；或者对所述小肽C端进行酰胺化、或在C端连有p-硝基苯胺或7-氨基-4-甲基香豆素；或者对所述小肽中间残基进行糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、硝基化、磺酸化或者连接PEG修饰或者所述小肽中间残基偶联蛋白质。本专利技术还提供所述的小肽在制备促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松产品中的应用。本专利技术还提供所述的小肽在制备用于促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松的药物中的应用。本专利技术还提供所述小肽的具有促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松的功能的食品。有益效果：本专利技术小肽B来源于大豆蛋白，安全性好，具有显著的促进成骨细胞增殖的作用，且能够显著可以显著促进成骨细胞的分化，因此有望用于制备促进成骨细胞增殖和抗骨质疏松的药物或功能食品。本专利技术小肽合成方便，可工业化生产，在食品、医药及化妆品等领域具有良好的应用前景。附图说明图1木瓜蛋白酶酶解产物浓度对成骨细胞增殖活力的影响，横坐标是木瓜蛋白酶酶解产物溶液的浓度。*表示与对照组相比差异显著(P＜0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(P＜0.01)图2超滤产物各组分对成骨细胞增殖活力的影响。不同字母表示差异显著(P＜0.05)。下同。图3SephadexG-15分离色谱图。图4各活性组分的促成骨细胞增殖活性。图5小肽B对成骨细胞增殖活力的影响，其中10、25、50和100表示小肽B的干预浓度，单位是μM。图6显示了小肽B对成骨细胞ALP(碱性磷酸酶)活力的影响，GQTPLFPR为加入了小肽B的孔。D7、D10分别表示小肽干预前培养时间为7、10天。具体实施方式试验材料：大豆分离蛋白，上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；噻唑蓝(MTT)、木瓜蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；MC3T3-E1细胞株，上海中科院细胞库；胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)、α-MEM培养基、EDTA-胰酶(0.05％)、Penicillin-Streptomycin(100×)、PBS磷酸盐缓冲液，美国Gibco公司；碱性磷酸酶Alcalase2.4L，丹麦诺维信生物技术有限公司；SephadexG-15，GE(中国)医疗集团；其他试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。仪器与设备：SpectraMaxM2e酶标仪，美国MolecularDevices公司；蛋白纯化系统，上海沪西分析仪器有限公司；8400型超滤杯，美国Millipore公司；HY-1漩涡混合仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；微型垂直电泳系统、化学发光凝胶成像系统，美国Bio-rad公司；冷冻干燥机，美国Labconco公司；JY92-Ⅱ超声细胞粉碎仪，宁波新艺超声设备有限公司。成骨细胞的增殖活性测定:(1)设置加样组：将成骨细胞(MC3T3-E1)消化收集后配置成每毫升含5×104个细胞的悬浮液，在96孔板的每孔中加100μL该细胞悬浮液，置于37℃、CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁。细胞贴壁后去除培养液，每孔加入100μL待检样品，每个待检样品设置6个平行。将细胞在CO2培养箱中继续培养24h后，每孔加入10μL浓度为5mg·mL-1的MTT溶液，继续培养4h后将MTT溶液及培养液吸出并加入50μLDMSO，然后在37℃恒温振荡器内振荡20min后使用酶标仪在570nm单波长下测吸光值。(2)另外，设置空白组和对照组。对照组以等体积的α-MEM培养液替代待检样品，其他同加样组。空白对照组中每孔加入100μL的PBS缓冲液，在CO2培养箱中培养48h后，每孔加入10μL浓度为5mg·mL-1的MTT溶液，继续培养4h后将MTT溶液和PBS缓冲液吸出并加入50μLDMSO，然后在37℃恒温振荡器内振荡20min后使用酶标仪在570nm单波长下测吸光值。(3)成骨细胞增殖活力＝(OD加样组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100％。实施例1制备促进成骨细胞增殖的活性肽的方法制备促进成骨细胞增殖的活性肽的方法，包括如下步骤：(1)木瓜蛋白酶酶解称取大豆分离蛋白(上海源叶生物科技有限公司,产品编号S30914)溶于超纯水中，配置成质量百分浓度为4.5％的蛋白溶液，加入NaOH溶液，调节pH为7.0。按照每克蛋白加入3000U木瓜蛋白酶的比例，在该蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶，然后置于旋转混匀仪上，在55℃进行酶解反应5h，经检测，大豆分离蛋白的水解度为11.08±0.31％。反应结束后，升温至85℃并保温20min以灭活木瓜蛋白酶，冷却至室温，在3000×g条件下离心15min，取上清，透析除盐，冷冻干燥后，得到木瓜蛋白酶酶解产物，于-20℃条件下保存。将木瓜蛋白酶酶解产物采用α-MEM培养液配制成50、100、150、200、250μg·mL-1的溶液。按照成骨细胞的增殖活性测定方法，以不同浓度木瓜蛋白酶酶解产物溶液作为待检样品，检测各样品干预后成骨细胞增殖活力。结果如图1所示，木瓜蛋白酶酶解产物溶液浓度为的100μg·mL-1和150μg·mL-1时，成骨细胞增殖活力相比对照组有所增强(P<0.05)，当浓度为200μg·mL-1和250μg·mL-1时相比对照组具有极显著差异(P<0.01)，但这二剂量之间无显著性差异(P>0.05)。当木瓜蛋白酶酶解产物溶液的浓度为200μg·mL-1时，成骨细胞增殖活力为118.24±2.73％。(2)超滤膜分离将步骤(1)所得木瓜蛋白酶酶解产物溶于去离子水中，配置成10μg·mL-1的溶液，用0.45μm的纤维素膜过滤，除去其中的不溶物。将滤液采用10kDa超滤膜分离，分别得到截留液A和透过液A。将截留液A采用30kDa的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进成骨细胞增殖的小肽，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种促进成骨细胞增殖的小肽，具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


2.权利要求1所述小肽的修饰肽，其特征在于对成骨活性肽进行修饰，在成骨活性肽的N端、C端或中间残基上连接氨基酸、多肽、蛋白质或PEG。


3.根据权利要求2所述修饰肽，其特征在于对所述小肽的修饰包括：对所述小肽的N端进行甲酰化或乙酰化，或者在N端连接脂肪酸、肼基烟酰胺、二乙烯三胺五乙酸、肉豆蔻酸、十六酸或琥珀酰胺或PEG；或者对所述小肽C端进行酰胺化、或在C端连有p-硝基苯胺或7-氨基-4-甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈新春，汪芳，宋海昭，李宇，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32