抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用，属于分子生物技术领域及免疫学领域。本发明专利技术包括：(1)分析预测水稻OsP31蛋白抗原性，选择多肽蛋白序列作为免疫抗原；(2)构建含有抗原的表达载体；(3)利用所述表达载体转化大肠杆菌；(4)表达并纯化所述多肽；(4)使用所述多肽或含有所述多肽的组合物免疫哺乳动物；(5)从所述哺乳动物血清中纯化抗体，即得抗水稻育性发育蛋白OsP31抗体。本发明专利技术所提供特异性抗体，能够通过免疫荧光染色技术特异性识别水稻中育性发育蛋白OsP31，能够检测及区分水稻减数分裂、雄配子发育等过程中的相关突变体，亲和力强、特异性好，具备工业化生产的可能性。

【技术实现步骤摘要】
抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物
及免疫学领域，更具体地说，涉及抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
减数分裂是所有有性生殖生物中一种高度保守细胞分裂过程。减数分裂整个过程包括一次DNA复制和连续两次细胞核的分裂，细胞学上可以定义为减数分裂I和II。在减数分裂前期I，同源染色体配对、联会和重组，随后在后期I发生分离，在末期I的时候两个姐妹染色单体被拉向两极。同源重组对于遗传多样性的保持是必不可少的，同时也是同源染色体正常分离的先决条件。联会复合体是减数分裂前期I的标志性结构，其正确形成及解离是同源染色体配对、联会、重组及分离等的必要保障。从结构上分析，联会复合体为一拉链样结构。拉链的轴形成于减数分裂细线期，联会后成为联会复合体拉链的两条平行骨架，因此染色体轴也通常被称为联会复合体侧向元件，其蛋白通常被称为侧向元件蛋白。联会复合体的装配从减数分裂前期I开始，并从偶线期开始组装，粗线期趋于成熟并发挥功能，到双线期开始解体。植物中研究表明，从偶线期到粗线期，组成侧向元件的同源染色体被横向纤维蛋白紧密的联系在一起，而中央元件蛋白则形成在中心位置；到了粗线期晚期，联会复合体将逐渐解体；到了双线期，联会复合体基本上已经完全解体了，而同源染色体则仍然被交叉结所维系在一起，这一过程对于同源染色体的正确分离是至关重要的。减数分裂的重要意义在于不仅使后代的染色体数目保持恒定，又通过同源重组使个体间的遗传物质在双亲染色体之间发生交换，从而维持了物种的遗传多样性并促进了物种的进化。对于动植物来说，减数分裂这一最基本特征给遗传改良带来了无限广阔的机遇。水稻OsP31就是一个在水稻花粉发育过程中起重要控制作用的关键基因(GeneID：4338221)，充分研究该基因将为在水稻雄性不育系的创新提供种质资源。随着对育性机制研究的不断深入，在水稻减数分裂进程中相关蛋白的表达变化属于极其灵敏的指标，通过研究这些基因的多克隆抗体在细胞学水平上的分布和变化情况将有利于研究者和育种家进一步充分认识水稻育性发育的机理机制，而以往对于育性过程中的基因的研究局限于细胞学表型观察，花药形态分析以及基因表达变化研究等，这些研究仅能说明该蛋白功能上的变化，并不能充分反映相关特异性蛋白在其特异组织时空变化情况，也不能完整反映在整个减数分裂中的变化情况；此外，这些蛋白在细胞学水平上与其他减数分裂育性蛋白的关系也无法明确。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种抗水稻育性蛋白OsP31多克隆抗体。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供制备所述抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的方法。本专利技术还要解决的最后一个技术问题在于提供所述抗水稻育性蛋白OsP31多克隆抗体的具体应用。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种水稻OsP31蛋白的免疫抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO.15所示。含有所述免疫抗原的免疫组合物。含有编码所述多肽的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系。一种抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的制备方法，使用氨基酸序列如SEQIDNO.15所示的水稻OsP31蛋白的免疫抗原或其组合物免疫哺乳动物。进一步地，所述方法具体包括：(1)构建含有所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原的重组表达载体；(2)使用重组表达载体制备重组微生物或重组细胞系；(3)表达并纯化所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原；(4)使用所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原或含有所述水稻OsP31蛋白的免疫抗原的组合物免疫，免疫动物为兔、小鼠、大鼠、山羊等中的一种；(5)从所述哺乳动物血清中纯化抗体，即得抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体。进一步地，所述重组微生物是大肠杆菌。任一所述的抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的制备方法制备得到的抗体。所述的抗体能应用于基于抗原抗体反应监测目的蛋白在植物细胞中定位或分布规律中的应用，尤其是应用于免疫荧光染色实验。进一步地，所述的植物为水稻、玉米、油菜、小麦或大豆。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：1)本专利技术制备的抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与水稻OsP31蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。2)本专利技术制备的抗体，是从多个候选多克隆抗体中挑选出来，能够进行免疫荧光组化分析的特异性抗体，可对水稻不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行精确分析，可以在一切与水稻育性发育相关的机理机制研究中应用，为水稻OsP31蛋白的功能和作用机理的研究提供检测与验证技术支持。例如可通过免疫组化、免疫印迹等方法观察水稻及其它植物中育性蛋白OsP31的细胞定位，揭示调控植物减数分裂和育性控制的机制，阐明植物花发育与植物有性生殖的内在联系，从而利用育性调控机制为植物遗传改良奠定理论和技术基础。3)本专利技术所制备抗体是一种特异性识别抗原的功能性蛋白。主要识别的是蛋白质的一级结构，也就是其具有抗原性的氨基酸序列。采用抗体来识别水稻OsP31蛋白，能准确的反应蛋白质的含量，而不会由于样本处理或保存条件不当，而引起结构变化导致无法检出。附图说明图1为根据表1设计的7个抗原所扩增产物在基因全长DNA上的位置示意图；图2为利用引物组合SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所得的抗原7纯化后的OsP31原核表达蛋白SDS-PAGE鉴定电泳图，其中，1为蛋白Marker(KDa)；2为标准蛋白BSA；3和4为纯化的蛋白；箭头指示的条带为目标蛋白条带；图3为抗原7所对应的多克隆抗体Western检测图，其中，1为蛋白Marker；2-4为野生型日本晴材料中OsP31抗体定位，5-6为突变体材料中OsP31抗体定位；图4为抗原7免疫所得OsP31多克隆抗体在野生型花粉母细胞中与OsREC8蛋白的定位信号分析图，标尺长度为5μm；图5为利用免疫荧光染色实验技术检测OsP31抗体(抗原7免疫所得多克隆抗体)在水稻不同突变体中的应用结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pMD19-T载体：北京华奥正生科技有限公司产品，其产品目录号为3271。PET30载体：pET30a(美国Novagen公司，货号69909-3)。BL21表达菌株：(北京全式金生物技术有限公司，货号CD601)。水稻品种中籼3037：记载“Wang，K.，Tang，D.，Hong，L.，Xu，W.，Huang，J.，Li，M.，Gu，M.，Xue，Y.andCheng，Z.(2010)DE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻OsP31蛋白的免疫抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种水稻OsP31蛋白的免疫抗原，其氨基酸序列如SEQIDNO.15所示。


2.含有权利要求1所述的免疫抗原的免疫组合物。


3.含有编码权利要求1所述免疫抗原的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系。


4.一种抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的制备方法，其特征在于，使用氨基酸序列如SEQIDNO.15所示的水稻OsP31蛋白的免疫抗原或其组合物免疫哺乳动物。


5.根据权利要求4所述的抗水稻育性发育蛋白OsP31多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)构建含有所述免疫抗原的重组表达载体；
(2)使用重组表达载体制备重组微生物或重组细胞系...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪剑辉，周颖君，高清松，刘廷武，罗玉明，李正鹏，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32