利用搭桥技术防止植物愈伤褐化和胶状物形成的有效方法技术

本发明专利技术公开一种利用搭桥技术防止植物愈伤褐化和胶状物形成的有效方法，该方法包括：将无菌滤纸铺在玻璃瓶内的植物凝胶液表面，配制1号、2号、3号固定液，将固定液加入装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的玻璃瓶内，接入经灭菌处理的外植体进行培养，其培养依次分三个阶段，各阶段的固定液依次是1号、2号、3号固定液，然后在新的经高温灭菌装有植物凝胶液的玻璃瓶内加入3号固定液摇匀，再在其表面铺满经灭菌处理的对应的外植体的植物叶片，再接入经第三阶段培养的材料进行培养。本发明专利技术方法减少了愈伤分泌出的物质对培养基的污染，解决了长期以来植物诱导愈伤易出现褐化和胶状物形成的困扰，大幅度提高了愈伤诱导率。大幅度提高了愈伤诱导率。

【技术实现步骤摘要】
利用搭桥技术防止植物愈伤褐化和胶状物形成的有效方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及防止植物愈伤褐化和胶状物形成的有效方法。

技术介绍

[0002]植物组织培养是指利用植物细胞的全能性原理，在无菌条件下，将离体的植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子)，组织、细胞、原生质体等，在配制好的培养基上培养，使其长出完整植株。由于培养是脱离植物母体的培养物，也称为离体培养。目前植物组织培养技术应用广泛，最有效的一个方面是进行植物脱毒及离体快繁。通过该技术可以保持优良品种，提高产量，而且具有比常规繁殖方法快数十万倍的速度繁殖优势，对增收、规模化生产以及推动我国农业生产发展具有重要意义。
[0003]本方法通过对以下三种植物进行实验:
[0004]野生稻是栽培稻的原始祖先，长期生长在野外经受了各种逆境胁迫的选择，遗传多样性丰富，保存有大量栽培稻不具有或已经消失了优异基因，具有重要的学术价值和经济价值。其中药用野生稻(Oryza officinalis Wall.ex wstt)是最具有研究价值的资源。
[0005]药用野生稻为多年生禾本科植物，具有超大穗、超宽叶片、超粗茎秆、抗虫抗病及抗逆能力非常强，其基因组、基因型和栽培稻、普通野生稻的差异很大。由于其特殊性，如果发掘利用，对水稻育种和生产将会取得突破性进展。然而在组培中愈伤褐化严重、胶状物分泌过多，阻碍了分化的形成，这是亟待解决的首要问题。
[0006]山药(Dioscoreae Rhizoma)为薯蓣科薯蓣属中能形成地下肉质块茎的栽培种，一年生或多年生缠绕性藤本植物，别名淮山、怀山药等。山药是一种药食兼用的高产、高效经济作物，目前薯蓣在国内外需求量不断增加，使山药生产开发供不应求。长期以来繁殖采用块茎切段方式，块茎切开伤口出现严重褐化和分泌出较多的粘性胶状物，并且出现品质退化、品种变异，产量降低。利用组培快繁技术培养中同样出现的褐化和粘性胶状物的问题一直以来没有得到有效解决。
[0007]近年来花卉组织培养及快繁脱毒技术越来越多地应用于花卉种苗繁殖生产中，国外花卉组培苗，产业化生产得到了较快发展，世界各国竞相投资,世界最大的花卉王国荷兰，其花卉种苗的组织培养已相当普及，在无性繁殖的花卉种苗中，80％以上是通过组培繁殖。国内花卉组培苗产业化，现已处于国际领先水平,开发利用实现了规模化、产业化。
[0008]蓝星花(Evolvulus nuttallianus)为旋花科、蓝星花属多年生半蔓性常绿灌木，原产美洲，我国各地均有栽培。蓝星花植株清新，花色雅致，花期全年，适合庭院美化，盆栽，也可用于花坛布置或做地被植物。在组培诱导愈伤中，最棘手的问题也是愈伤褐化和胶状物的形成，得不到控制，抑制了愈伤的出愈率，使苗的分化过低。
[0009]组织培养的目的在于利用生物技术手段快速获得大量规模化的组培苗，然而要获得大量分化苗与愈伤诱导率、愈伤增殖率以及愈伤质量好坏和数量的多少密切相关。要获得优质愈伤必须首先解决在愈伤诱导中出现的褐化和胶状物。过去曾有学者对组培中植物
出现褐化进行过研究，采取方法：例如：水洗、多次转移培养基或在培养基中添加吸附剂和抗氧化剂(活性炭、维生素C、亚硫酸钠、聚乙烯比咯烷酮)等化学试剂。鲁旭东于1999年就植物培养中褐化的发生与防治进行了简单阐述(鲁旭东，植物组织培养中褐变的发生及防止，农业与科技，1999年8月第4期)。于清章等1998年利用几种防褐变剂对去皮切片马铃薯进行处理，取得一定防褐效果(于清章等.几种防褐变剂对去皮切片马铃薯贮藏的影响.长江蔬菜，1998，11:25)。王东霞等于2002年就如何对花卉组织培养中的褐变进行阐述(王东霞.如何对抗植物组培中的组织褐变.中国花卉盆景，2002.12)。同时也有学者在山药组织培养中的褐化现象做过去褐化处理，均有一定效果。以上列举主要添加化学试剂来抑制褐化，在诱导愈伤采用添加化学试剂方法抑制褐化的同时，也同样抑制了出愈率及愈伤增殖率，更严重抑制了后期的分化成苗率，当弊大于利时，只能寻找更好的方法。曾经采用水洗愈伤或更换培养基方法，暂时抑制外植体褐化，培养几天后甚至褐化更严重，胶状物疯狂长满整个培养瓶。通过查阅相关资料，在野生稻和其它植物组培方面，愈伤诱导应用物理手段有效控制和防止愈伤褐化形成方面，未见报道。在胶状物的有效控制方面未曾提及和报道过。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于克服了植物愈伤诱导、愈伤增殖出现的严重褐化和胶状物形成的棘手难题，提出一种不添加任何化学试剂，而是利用搭桥技术物理手段有效防止愈伤褐化和胶状物形成的方法。
[0011]术语：胶状物是一种不溶于水带粘性的透明的像凝胶的一种物质。
[0012]本专利技术提供的利用搭桥技术防止植物愈伤褐化和胶状物形成的有效方法，包括以下步骤：
[0013](1)外植体无菌处理；外植体经无菌处理后放入超净工作台备用；
[0014](2)植物凝胶液的配制：按3g植物凝胶溶于1000ml蒸馏水的比例将植物凝胶溶于蒸馏水中得到植物凝胶液，按每瓶装40ml植物凝胶液分装于玻璃瓶中，高温灭菌，备用；
[0015](3)无菌滤纸的装配：将无菌滤纸铺在步骤(2)中经高温灭菌装有植物凝胶液的玻璃瓶中的植物凝胶液表面得到装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的玻璃瓶，备用；
[0016](4)植物叶片无菌处理：剪取步骤(1)所述外植体的叶片进行灭菌处理，植物叶片的无菌处理现用现灭菌处理；
[0017](5)配制1号、2号、3号固定液：
[0018]1号固定液：MS+2,4
‑
D 5mg/L+蔗糖30％，PH 5.8
‑
6.0；
[0019]2号固定液：MS+2,4
‑
D4mg/L+蔗糖30％,PH 5.8
‑
6.0；
[0020]3号固定液：MS+2,4
‑
D6mg/L+蔗糖30％,PH 5.8
‑
6.0；
[0021](6)防止愈伤褐化和胶状物形成的第一阶段愈伤诱导培养：先将1号固定液加入步骤(3)装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的液玻璃瓶中，再接入步骤(1)中所述的经无菌处理的外植体，置于27～28℃，暗培养30～40天；
[0022](7)防止愈伤褐化和胶状物形成的第二阶段愈伤诱导培养：将2号固定液加入步骤(3)新的装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的玻璃瓶中，再接入步骤(6)第一阶段愈伤诱导培养的材料，置于27～28℃，暗培养35～40天；
[0023](8)防止愈伤褐化和胶状物形成的第三阶段愈伤诱导培养：将3号固定液加入步骤
(3)新的装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的玻璃瓶中，再接入步骤(7)第二阶段愈伤诱导培养的材料，置于27～28℃，暗培养35天；
[0024](9)防止愈伤褐化和胶状物形成的第四阶段愈伤增殖培养：将3号固定液加入步骤(2)中经高温灭菌装有植物凝胶液的玻璃瓶中，摇匀，再在其玻璃瓶内液体表面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用搭桥技术防止植物愈伤褐化和胶状物形成的有效方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体无菌处理；外植体经无菌处理后放入超净工作台备用；(2)植物凝胶液的配制：按3g植物凝胶溶于1000ml蒸馏水的比例将植物凝胶溶于蒸馏水中得到植物凝胶液，按每瓶装40ml植物凝胶液分装于玻璃瓶中，高温灭菌，备用；(3)无菌滤纸的装配：将无菌滤纸铺在步骤(2)中经高温灭菌装有植物凝胶液的玻璃瓶中的植物凝胶液表面得到装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的玻璃瓶，备用；(4)植物叶片无菌处理：剪取步骤(1)所述外植体的叶片进行灭菌处理，植物叶片的无菌处理现用现灭菌处理；(5)配制1号、2号、3号固定液：1号固定液：MS+2,4
‑
D5mg/L+蔗糖30％，PH 5.8
‑
6.0；2号固定液：MS+2,4
‑
D4mg/L+蔗糖30％,PH 5.8
‑
6.0；3号固定液：MS+2,4
‑
D6mg/L+蔗糖30％,PH 5.8
‑
6.0；(6)防止愈伤褐化和胶状物形成的第一阶段愈伤诱导培养：先将1号固定液加入步骤(3)装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的液玻璃瓶中，再接入步骤(1)中所述的经无菌处理的外植体，置于27～28℃，暗培养30～40天；(7)防止愈伤褐化和胶状物形成的第二阶段愈伤诱导培养：将2号固定液加入步骤(3)新的装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的玻璃瓶中，再接入步骤(6)第一阶段愈伤诱导培养的材料，置于27～28℃，暗培养35～40天；(8)防止愈伤褐化和胶状物形成的第三阶段愈伤诱导培养：将3号固定液加入步骤(3)新的装有植物凝胶液并铺有无菌滤纸的玻璃瓶中，再接入步骤(7)第二阶段愈伤诱导培养的材料，置于27～28℃，暗培养35天；(9)防止愈伤褐化和胶状物形成的第四阶段愈伤增殖培养：将3号固定液加入步骤(2)中经高温灭菌装有植物凝胶液的玻璃瓶中，摇匀，再在其玻璃瓶内液体表面铺满步骤(4)中所述的经无菌处理的植物叶片，并将步骤(8)第三阶段愈伤诱导培养的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲，王玲仙，王波，程在全，付坚，柯学，肖素勤，钟巧芳，张墩宇，张云，殷富有，蒋聪，李娥贤，余腾琼，雷涌涛，邢佳鑫，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：