一种便捷高效的番茄转基因方法技术

本发明专利技术公开了一种便捷高效的番茄转基因方法，改进主要体现在：1.改良培养基的配方，获得活力更强的外植体；2.通过调整激素配比，加快阳性苗的生长速度，从而达到区分阳性芽体和非阳性芽体的目的；3.从各个操作环节以处理时间改为外植体的生长状态为参照，增强了转基因的可把控性；4.芽体生长、生根和炼苗无缝衔接，减少了人工操作，降低了染菌的风险。降低了染菌的风险。降低了染菌的风险。

【技术实现步骤摘要】
一种便捷高效的番茄转基因方法


[0001]本专利技术涉及转基因
，特别涉及一种便捷高效的番茄转基因方法。

技术介绍

[0002]番茄原产自南美洲，是一种喜温、喜光的短日照植物，生长周期 4～6个月，对土壤要求不严格，以pH 6～7为宜。番茄作为一种营养丰富的蔬菜，风味极佳，也常被当做水果食用，其果实含有丰富的微量元素，维生素及可溶性糖，具有增强人体免疫力、消暑解渴、促进消化的功效。世界范围内，番茄及其制品的贸易在蔬菜贸易中占据着重要的地位。近年来，中国的番茄产业发展迅速，已位居全球第一位，因此通过转基因技术精准的提高番茄风味，增强番茄的适应性，扩大其种植范围，具有很高的经济价值。此外，番茄的基因组序列信息已完成测定，而且番茄生长周期相对于果树要短很多，故番茄已作为一种研究果实品质的模式植物，广泛用于科学研究工作中。因此改良和开发高效的番茄转基因技术，可以为其他水果的研究提供参照，具有很高的科研价值。
[0003]利用农杆菌介导的转基因技术通常包括靶基因的获取，表达载体的构建，农杆菌转化和植物组织培养这个四个环节，其中植物组织培养是最核心，难度最大，周期最长的部分，同时也是限制某种植物能否实现转基因的关键因素。就目前的研究结果显示，番茄组培理论上只需要56天，但是由于转基因过程需要细菌侵染，添加抗生素等操作，会限制番茄外植体的生长，导致番茄转基因周期延长，即便是专业的转基因公司，获得阳性的转基因材料也需要3～6个月，且转基因操作比较繁琐，影响因素较多，导致转基因操作的稳定性难以把控。
[0004]传统的转基因方法存在如下缺点：
[0005]1.操作繁琐，由于材料本身及培养条件的差异，致使各个时期实验材料的生长状况都不相同，不同批次之间的波动很大，难以把控成功率。
[0006]2.侵染完成后，黑暗环境下放置2天，农杆菌过量繁殖，会降低外植体的活性，减缓愈伤组织及芽体的生长，导致实验周期延长。目前专业的转基因公司，也需要3～6个月才能完成整个转基因流程。
[0007]3.该方法利用转基因芽体具有抗性基因，通过添加大量抗生素来抑制正常芽体的生长，从而区分转基因与非转基因芽体。转基因芽体虽然具有抗性，但也需要合成分解抗生素的蛋白质，因此抗生素环境对转基因苗也是一种胁迫，会降低转基因芽体的生长速度，延长实验周期。另外，番茄对潮霉素敏感，因此番茄转基因不适宜用潮霉素抗性，故传统的转基因方法对转基因载体也有要求。

技术实现思路

[0008]为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种便捷高效的番茄转基因方法；本专利技术对传统的番茄转基因方法进行了改进，大大缩短了转基因的周期，并且提高了阳性率，本专利技术的改进主要体现在：1.改良培养基的配方，获得活力更强的外植体；2.
通过调整激素配比，加快阳性苗的生长速度，从而达到区分阳性芽体和非阳性芽体的目的；3.从各个操作环节以处理时间改为外植体的生长状态为参照，增强了转基因的可把控性；4.芽体生长、生根和炼苗无缝衔接，减少了人工操作，降低了染菌的风险。
[0009]为达到上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0010]一种便捷高效的番茄转基因方法，包括如下步骤：
[0011]步骤一、无菌苗的培养
[0012]用10％～15％的NaClO消毒15～20min，无菌水漂洗5次，避光室温下静置过夜；之后将种子平铺在1/2MS培养基上，约7～10天种子即可萌发，并生出2片肥厚的子叶；
[0013]步骤二、外植体培养
[0014]用灭菌过的剪刀和镊子，将番茄幼苗的子叶剪下，铺在预培养基上，叶片正面向下，每个平皿50～60片子叶为宜，黑暗避光24～30h，待叶片切口处呈现膨大迹象，即用于步骤四；
[0015]步骤三、农杆菌准备
[0016]将构建好或者冻存的农杆菌取出，涂在含有相应抗生素的LB平板上，挑取单克隆，在含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、 200rpm过夜培养至OD600＝0.5；取该农杆菌300μL接种在新的 30mL LB培养基中，28℃、200rpm摇5～6h；之后将农杆菌离心，弃去上清，用30mL液体培养基：MS 4.3g/L，蔗糖30g/L，pH 5.5～6.0 重悬，混匀待用；
[0017]步骤四、外植体侵染
[0018]将预培养过的番茄子叶，在步骤3中的农杆菌悬液中浸泡20 min，每隔5min轻轻颠倒或旋转，使叶片尽可能的与菌液接触完全；之后用灭菌过的纸巾吸干子叶表面的菌液，避免压迫使叶片受损；将叶片放在预培养基上，黑暗培养2d，在此期间若叶片周围有农杆菌生长迹象，应终止黑暗培养，立即进入步骤五；
[0019]步骤五、诱导愈伤及除菌
[0020]将步骤四中的子叶，转移至抗性培养基，约5～7d切口处即可形成愈伤组织团块；
[0021]步骤六、诱导出芽
[0022]将带有愈伤组织的子叶，转移至激素板上，约7～10d子叶上形成新的芽体；要求此培养基厚度约0.7～1cm；
[0023]步骤七、生根培养
[0024]用灭菌过的镊子和剪刀从茎端，取下步骤五中的芽体，插在生根培养基中，每隔7～10天，松动一下培养瓶瓶口，约15天生根，待根系发育强壮后即可移栽。
[0025]进一步的，所述步骤一中，MS培养基具体为MS 2.15g/L，蔗糖30g/L，7g/L琼脂，pH 5.5～6.0。
[0026]进一步的，所述步骤二中预培养基具体为：MS 4.3g/L，蔗糖30 g/L，IAA 0.2mg/L，6
‑
BA2 mg/L，琼脂7g/L，pH 5.5～6.0。
[0027]进一步的，所述步骤五中抗性培养基具体为MS 4.3g/L,蔗糖30 g/L,IAA 0.1mg/L，6
‑
BA 2mg/L,Timentin 300mg/L,Kan 200mg/L，琼脂7g/L,pH 5.5～6.0。
[0028]进一步的，所述步骤六中，所述激素板包含：MS 4.3g/L,蔗糖 30g/L,IAA 0.1mg/L，6
‑
BA 3mg/L,Timentin 150mg/L,Kan 50mg/L，琼脂7g/L,pH 5.5～6.0。
[0029]进一步的，所述步骤七中，生根培养基具体为：MS 4.3g/L,蔗糖30g/L,Kan 100mg/
L,Timentin 300mg/L,琼脂7.5g/L,pH 5.5
‑
6.0，选择性加IAA0.1 mg/L。
[0030]相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0031]本专利技术对传统的番茄转基因方法进行了改进，大大缩短了转基因的周期，并且提高了阳性率，本专利技术的改进主要体现在：
[0032]1.改良培养基的配方，获得活力更强的外植体；
[0033]2.通过调整激素配比，加快阳性苗的生长速度，从而达到区分阳性芽体和非阳性芽体的目的；
[0034]3.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种便捷高效的番茄转基因方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、无菌苗的培养用10％～15％的NaClO消毒15～20min，无菌水漂洗5次，避光室温下静置过夜；之后将种子平铺在1/2MS培养基上，约7～10天种子即可萌发，并生出2片肥厚的子叶；步骤二、外植体培养用灭菌过的剪刀和镊子，将番茄幼苗的子叶剪下，铺在预培养基上，叶片正面向下，每个平皿50～60片子叶为宜，黑暗避光24～30h，待叶片切口处呈现膨大迹象，即用于步骤四；步骤三、农杆菌准备将构建好或者冻存的农杆菌取出，涂在含有相应抗生素的LB平板上，挑取单克隆，在含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养至OD600＝0.5；取该农杆菌300μL接种在新的30mL LB培养基中，28℃、200rpm摇5～6h；之后将农杆菌离心，弃去上清，用30mL液体培养基：MS 4.3g/L，蔗糖30g/L，pH 5.5～6.0重悬，混匀待用；步骤四、外植体侵染将预培养过的番茄子叶，在步骤3中的农杆菌悬液中浸泡20min，每隔5min轻轻颠倒或旋转，使叶片尽可能的与菌液接触完全；之后用灭菌过的纸巾吸干子叶表面的菌液，避免压迫使叶片受损；将叶片放在预培养基上，黑暗培养2d，在此期间若叶片周围有农杆菌生长迹象，应终止黑暗培养，立即进入步骤五；步骤五、诱导愈伤及除菌将步骤四中的子叶，转移至抗性培养基，约5～7d切口处即可形成愈伤组织团块；步骤六、诱导出芽将带有愈伤组织的子叶，转移至激素板上，约7～10d子叶上形成新的芽体；要求此培养基厚度约0.7～1cm；步骤七...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏飞，李爽，杨建立，范伟，
申请(专利权)人：许昌仓羽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：