一种外周血造血干细胞采集物来源的嵌合抗原受体T细胞的制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种外周血造血干细胞采集物来源的嵌合抗原受体T细胞的制备及应用，其具体公开了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其包括以下步骤：1）获得以粒细胞集落刺激因子刺激后采集得到的外周血造血干细胞采集物；2）由所述外周血造血干细胞采集物中分离，并以磁珠筛选方法获得T淋巴细胞；3）激活T淋巴细胞，并以包含嵌合抗原受体的慢病毒载体或慢病毒转导或感染激活的T淋巴细胞，得到嵌合抗原受体T细胞。本发明专利技术采用外周血造血干细胞采集物作为T细胞采集来源，用量少，仅需要1 mL外周血造血干细胞采集物即可制备嵌合抗原受体T细胞（CAR‑T细胞）的需求。

【技术实现步骤摘要】
一种外周血造血干细胞采集物来源的嵌合抗原受体T细胞的制备及应用
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种G-CSF动员后外周血造血干细胞来源的嵌合抗原受体T细胞的制备及应用。
技术介绍
嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimericantigenreceptor-modifiedTcells，CART)，是一种基因工程手段修饰后的T细胞。嵌合抗原受体由特异性靶向肿瘤细胞抗原胞外单链可变片段(singlechainfragmentvariable，scFv)、铰链区、跨膜结构域和胞内信号结构域组成。近些年，CART治疗取得了巨大的成功，为治愈肿瘤提供了免疫治疗方面全新的选择。近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，也被用来治疗实体瘤，具有广阔的应用空间。CAR-T细胞治疗作为一种新型的细胞治疗手段，其生产过程繁琐。主要涉及：病毒质粒改造及生产、慢病毒包装及浓缩、患者外周血T细胞获取、T细胞感染及扩增等几个方面。每个过程产生问题都会严重影响下游的生产，所以每一步都必须严格质量控制。现有技术CAR-T细胞中的T细胞来源于不同患者个体的外周血，其T细胞的异质化程度高、导致工艺性能稳健性较差，较难设定统一的标准限度。此外，有些患者的T细胞数量极低，很难分离达到培养所需的数量细胞，不利于细胞生产的规模化和质量控制，无法解决产业化的需求。且患者来源T细胞可能存在免疫功能缺陷，在体外存在培养失败的风险，在体内存在免疫逃逸的现象，存在较大工艺失败的可能(10％左右)。且为了达到培养T细胞的数量要求，需要大量的患者外周血，给实际应用带来困难。造血干细胞(hematopoieticstemcells)是一类异质性的、具有自我更新和多向血细胞分化潜能的成体干细胞。根据来源不同，其可分类为骨髓造血干细胞、脐血造血干细胞、胎肝造血干细胞和外周血造血干细胞。外周血造血干细胞是存在于外周血中的一类具有高度更新能力和多向分化潜能的最原始的起源细胞，正常生理条件下外周血造血干细胞的含量远远低于骨髓造血干细胞的含量，约占骨髓中的0.1％-1％，CD34+细胞仅占外周血单个核细胞(PBMC)的0.01％-0.1％，但是给予动员剂后，外周血中造血干细胞含量增加。目前普遍认为，外周血造血干细胞除了具有促进造血恢复和调节免疫外，还具有抗肿瘤作用。供者经粒细胞集落刺激因子动员后采集的外周血造血干细胞采集物(G-PBSC)中的CD34+的造血干细胞在异基因造血干细胞移植和过继性细胞免疫治疗中具有相当重要的地位，G-PBSC除包含少量的造血干细胞，还包含对占主要成分的淋巴细胞和其他免疫细胞，目前针对G-PBSC来源中占有主要成分的淋巴细胞和其他免疫细胞研究较少，因为通常认为由于这一部分细胞分化程度较高，在异体中使用会导致较强的免疫作用，无法应用于异体或起到治疗作用。通过表面标志表达的不同，T细胞可分为几个主要亚群。这些细胞被命名为初始细胞(naiveTcell，TN)、干细胞样记忆T细胞(stemcellmemoryTcell，TSCM)、中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和、终末分化效应记忆T细胞(TEMRA)和过渡记忆T细胞(TTM)。虽然效应T细胞具有强大的溶解肿瘤的能力，但是其分化程度较高，持续性较弱。只有中央心记忆T细胞和其他低分化的T细胞子集，例如初始幼稚T细胞(naiveTcell，TN)和干细胞样记忆T细胞(stemcellmemoryTcell，TSCM)，可以在体内达到长时间的扩增以及较大的增殖能力。大量的临床数据证实，CAR-T细胞用于靶向CD19在治疗急性淋巴细胞白血病ALL、非霍奇金淋巴瘤NHL、慢性淋巴细胞白血病CLL凸显疗效。白细胞介素-3受体α链(IL-3Rα)，通常称为CD123，广泛过度表达于各种血液恶性肿瘤，包括急性髓系白血病病(AML)、B细胞急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、母细胞浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)。尤为重要的是，CD123在白血病干细胞(LSC)和分化程度更高的白血病母细胞中表达，使得CD123成为有吸引力的治疗目标。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术一个方面提供了一种嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备方法，其包括以下步骤：1)获得经粒细胞集落刺激因子动员后采集的外周血造血干细胞采集物(G-PBSC)；2)从所述外周血造血干细胞采集物中分离，并以磁珠筛选方法获得T淋巴细胞；3)激活T淋巴细胞，并将包含嵌合抗原受体的慢病毒载体或慢病毒转导或感染激活的T淋巴细胞，得到嵌合抗原受体T淋巴细胞。在本专利技术的具体实施方案中，所述的外周血造血干细胞采集物为受试者接受粒细胞集落刺激因子刺激后进行外周血造血干细胞采集获得的外周血造血干细胞采集物。本专利技术另一个方面提供了一种T淋巴细胞的分离方法，其包括以下步骤：1)获得以粒细胞集落刺激因子刺激后采集得到的外周血造血干细胞采集物；2)由所述外周血造血干细胞采集物中分离，并以磁珠筛选方法获得T淋巴细胞。在本专利技术优选的实施例中，在步骤2)中，所述外周血造血干细胞采集物经过分离获得外周血单个核细胞。在本专利技术的优选的实施例中，步骤2)中外周血造血干细胞采集物经过分离获得外周血单个核细胞的方法为将外周血造血干细胞采集物的稀释液加入细胞分离液上方，并进行离心，中间层即为外周血单个核细胞。在本专利技术优选的实施例中，上述离心的速度为300-500g。在本专利技术优选的实施例中，得到的外周血单个核细胞还进行1次以上的清洗。在本专利技术优选的实施例中，得到的外周血单个核细胞还以红细胞裂解液进行处理。在本专利技术的优选的实施例中，在步骤2)中，所述外周血造血干细胞采集物经过分离获得的外周血单个核细胞达到以下标准：a)分离所得的细胞中95±5％为单个核细胞；b)分离所得的细胞存活细胞率>90％；c)分离所得的细胞中粒细胞数量为3±2％；且d)分离所得的细胞中粒细胞数量为5±2％。在本专利技术优选的实施例中，在步骤2)中，分离获得外周血单个核细胞后将采用阴性筛选的方法去除造血干细胞和除T细胞以外的其他免疫细胞。在本专利技术优选的实施例中，其他免疫细胞选自B细胞、NK细胞、DC、单核细胞、粒细胞、红细胞。在本专利技术的具体实施方案中，步骤2)所得的T淋巴细胞中初始细胞、干细胞样记忆T细胞和中央记忆T细胞的数量总和占T淋巴细胞总数量的50％以上，优选为60％以上。在本专利技术的具体实施方案中，中央记忆T细胞数量和占T淋巴细胞总数量的25％以上；优选为30％以上，例如30％-40％。在本专利技术的具体实施方案中，初始细胞和干细胞样记忆T细胞数量总和占T淋巴细胞总数量的25％以上，优选为30％以上，例如30％-40％。在本专利技术的优选的实施例中，在步骤3)中，激活T淋巴细胞的方法为CD3/CD28激活磁珠进行激活。在本专利技术的优选的实施例中，通过步骤3)在T淋巴细胞表面获得嵌合抗原受体(CAR)或分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备方法，其包括以下步骤：/n1）获得以粒细胞集落刺激因子动员后采集得到的外周血造血干细胞采集物；/n2）由所述外周血造血干细胞采集物中分离，并以磁珠阴性筛选方法获得T淋巴细胞；/n3）激活T淋巴细胞，并以包含嵌合抗原受体的慢病毒载体感染激活的T淋巴细胞，得到嵌合抗原受体T淋巴细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备方法，其包括以下步骤：
1）获得以粒细胞集落刺激因子动员后采集得到的外周血造血干细胞采集物；
2）由所述外周血造血干细胞采集物中分离，并以磁珠阴性筛选方法获得T淋巴细胞；
3）激活T淋巴细胞，并以包含嵌合抗原受体的慢病毒载体感染激活的T淋巴细胞，得到嵌合抗原受体T淋巴细胞。


2.一种T淋巴细胞的分离方法，其包括以下步骤：
1）获得以粒细胞集落刺激因子刺激后采集得到的外周血造血干细胞采集物；
2）由所述外周血造血干细胞采集物中分离，并以磁珠阴性筛选方法获得T淋巴细胞。


3.根据权利要求1所述的制备方法或权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述的外周血造血干细胞采集物为健康受试者接受粒细胞集落刺激因子动员后进行外周血造血干细胞采集获得的外周血造血干细胞采集物。


4.根据权利要求1所述的制备方法或权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤2）所得的T淋巴细胞中初始细胞、干细胞样记忆T细胞和中央记忆T细胞的数量总和占T淋巴细胞总数量的50%以上，优选为60%以上；
更优选地，中央记忆T细胞数量和占T淋巴细胞总数量的25%以上；
更优选地，初始细胞和干细胞样记忆T细胞数量总和占T淋巴细胞总数量的25%以上。


5.根据权利要求1所述的制备方法或权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在步骤2）中，分离获得外周血造血干细胞采集物中单个核细胞后将采用阴性筛选的方法去除其中的单核细胞、红细胞、NK细胞、粒细胞，保留T细胞、前T细胞、干细胞。


6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3）中，激活T淋巴细胞的方法为CD3/CD28激活磁珠进行激活。


7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3）中，慢病毒载体中包含编码靶向肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的序列；优选地，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原选自CD123、CD19、CD22、CD30、CD171、GD2、GD3、BCMA、TnAg、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、EphA2、FucosylGMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、SSEA-4、CD20、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)KIT、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、IL-13Ra2、间皮素、IL-llRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、E7、MAGEAl、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄雅静，
申请(专利权)人：因诺伟北京生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11