一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株制造技术

本发明专利技术公开一种用于GLP‑1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株。该载体包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、CRE‑Mini promoter元件和编码GFP的基因。本发明专利技术通过将该重组载体与表达RFP的重组载体分别通过病毒液形式感染表达GLP‑1R的细胞株，筛选分离，得到用于GLP‑1及其类似物活性测定的细胞株。本发明专利技术采用GFP作为报告基因，检测GLP‑1及其类似物活性时，无需裂解细胞等繁琐步骤，可直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒；所得到的细胞株拥有内参RFP矫正数据，检测结果更准确，稳定可信；所构建的细胞株检测药物范围广，通用性好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株
本专利技术属于药物生物活性测定
，尤其涉及一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株。
技术介绍
胰高血糖素样肽-1(Glucogan-likePeptide1,GLP-1)由小肠L细胞分泌，其作用于胰岛β细胞可以促进胰岛素基因的转录翻译和胰岛素释放，达到降血糖的效果。此外，GLP-1及其类似物还可以通过减少胰高血糖素的分泌、减慢肠蠕动、抑制胃排空、促进胰岛β细胞的增殖与分化、抑制β细胞凋亡等方式来综合调控血糖，更重要的是其降血糖效应具有明显的血糖依赖性，相比传统的降血糖药物其安全性更高，疗效更可靠。因此，GLP-1及其类似物已成为糖尿病治疗领域新的热门药物。我国是糖尿病大国，GLP-1及其类似物是糖尿病药物研究的重点领域，随着大量不同来源、结构性质各异的GLP-1及其类似物产生，能够快速检测、准确评价新的GLP-1及其类似物活性的方法是药物开发的重要依据和手段。GLP-1及其类似物作用于胰岛β细胞上胰高血糖素样肽-1受体(Glucogan-likePeptide1Receptor，GLP-1R)后的一条信号转导通路为：受体和配体结合后活化腺苷酸环化酶(AdenylateCyclase，AC)，进而促进胞内第二信使--环磷酸腺苷(CyclicAdenosinemonophosphate，cAMP)的生成，cAMP依赖的转录因子表达增加，cAMP进而激活蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)，PKA磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein，CREB)，CREB与CRE结合进而促进下游基因转录表达。目前用于检测GLP-1及其类似物活性的方法主要基于以下两方面：(1)检测胞内cAMP含量的变化间接反映GLP-1活性，该方法易受内源性因素干扰，准确性和稳定性都较差；(2)利用荧光素酶报告基因表达强度来反映GLP-1活性，该方法准确性和稳定性都较高，但需要相应的荧光素酶检测试剂盒，操作较为繁琐，成本较高。因此，开发一种准确性高、稳定性高、操作简便、成本低的GLP-1及其类似物活性检测方法具有重要现实意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，专利技术人通过设计并合成CRE反应元件序列，构建CRE-Minipromoter-GFP复合元件；其中，GFP(greenfluorescentprotein)为绿色荧光蛋白，所述慢病毒载体为自主灭活型(Selfinactivating)慢病毒载体，即慢病毒整合到宿主基因组后，5’LTR(longterminalrepeat)没有转录功能，且能够阻挡上游启动子序列的转录，因此，CRE-Minipromoter转录活性不受上游启动子活性影响。含有上述复合元件的慢病毒感染并将其基因组整合入宿主细胞基因组，GLP-1及其类似物结合细胞上GLP-1受体GLP-1R后，激活下游信号转导通路，磷酸化的CREB结合cAMP反应元件(cAMPresponseelement,CRE)进而促进GFP转录表达，通过GFP表达强度可以反映出GLP-1及其类似物的活性。该方法通过高性能多功能微孔板检测仪的荧光检测系统直接读取GFP荧光强度，敏感性高，无需裂解细胞、无需额外试剂或试剂盒，操作简便经济，可为GLP-1类药物早期研发及筛选评价提供重要评价手段。从而，本专利技术的首要目的是提供一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，其含CRE-Minipromoter-GFP复合元件的。本专利技术的另一目的在于提供上述用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体的应用。本专利技术的的再一目的在于提供应用上述用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体制备得到的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株及其应用。为了实现上述目的，本专利技术通过下述技术方案实现：一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、CRE-Minipromoter元件和编码GFP的基因，CRE-Minipromoter元件和编码GFP的基因分别与复制缺陷型慢病毒载体骨架连接，CRE-Minipromoter元件设置在编码GFP的基因的上游，通过CRE-Minipromoter控制GFP的表达。所述的复制缺陷型慢病毒载体骨架优选为自主灭活型慢病毒载体。所述的CRE-Minipromoter元件的序列如SEQIDNO.2所示。所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，优选通过如下步骤制备得到：以序列如SEQIDNO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将序列如SEQIDNO.2所示的CRE-Minipromoter构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP的GFP基因上游，得到用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体；其序列优选如SEQIDNO.3所示。所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体在制备用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株中的应用。一种用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，包含上述复制缺陷型慢病毒重组载体中的CRE-Minipromoter-GFP复合元件。所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，优选为其基因组具有如SEQIDNO.4所示的序列。所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，还含有能表达红色荧光蛋白RFP的基因序列；更优选为：其基因组含有能表达红色荧光蛋白RFP的基因序列。所述的红色荧光蛋白RFP用于做内参，矫正数据。所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株的制备方法，包括如下步骤：(1)将用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；或是将用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体分别与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；(2)将步骤(1)获得的病毒液感染表达GLP-1R的细胞株，经抗生素筛选后获得稳转细胞库；(3)对步骤(2)的细胞库进行分离、筛选得到用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株。步骤(1)中所述的含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体具有如下结构：RFP的启动子为SV40启动子，哺乳动物细胞抗性筛选标记与所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体的哺乳动物细胞抗性筛选标记不同，优选通过如下步骤制备得到：(A)将复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP上的6xTetO-miniCMV更换为SV40启动子，得到含SV40-GFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体；(B)将含SV40-GFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体上GFP片段更换为RFP，得到含SV40-RFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体；(C)将含SV40-RFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体上嘌呤霉素抗性(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，其特征在于：包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、CRE-Mini promoter元件和编码GFP的基因，CRE-Mini promoter元件和编码GFP的基因分别与复制缺陷型慢病毒载体骨架连接，CRE-Mini promoter元件设置在编码GFP的基因的上游。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，其特征在于：包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、CRE-Minipromoter元件和编码GFP的基因，CRE-Minipromoter元件和编码GFP的基因分别与复制缺陷型慢病毒载体骨架连接，CRE-Minipromoter元件设置在编码GFP的基因的上游。


2.根据权利要求1所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，其特征在于：
所述的复制缺陷型慢病毒载体骨架为自主灭活型慢病毒载体；
所述的CRE-Minipromoter元件的序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，其特征在于：所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体的序列如SEQIDNO.3所示。


4.权利要求1～3任一项所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体在制备用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株中的应用。


5.一种用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，其特征在于：包含权利要求1～3任一项所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体中的CRE-Minipromoter-GFP复合元件；进一步地，其基因组具有如SEQIDNO.4所示的序列。


6.根据权利要求5所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，其特征在于：还含有能表达红色荧光蛋白RFP的基因序列；进一步地，其基因组含有能表达红色荧光蛋白RFP的基因序列。


7.权利要求5或6所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将权利要求1～3任一项所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；或是将权利要求1～3任一项所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体分别与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；
(2)将步骤(1)获得的病毒液感染表达GLP-1R的细胞株，经抗生素筛选后获得稳转细胞库；
(3)对步骤(2)的细胞库进行分离、筛选得到用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株。


8.根据权利要求7所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的包装的步骤如下：
(a)将权利要求1～3任一项所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与包装质粒混合后，得到DNA混合液转染包装细胞；当使用用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺华，李靖，曹春来，陈康月，韦苏珍，
申请(专利权)人：珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44