一种重组慢病毒载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种重组慢病毒载体及其制备方法与应用。所述重组慢病毒载体包括插入有绿色荧光基因EGFP及钙调素依赖性蛋白激酶II基因的慢病毒载体。本发明专利技术提供的重组慢病毒载体对细胞的毒性小，且制备方法简单，易于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种重组慢病毒载体及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种慢病毒载体及其制备方法与应用。
技术介绍
钙离子在细胞的生理活动中起着重要的作用，游离钙离子浓度的变化与细胞的功能、信号的传递及其损伤和凋亡都有着密切的联系。钙离子是单个细胞生存和死亡的信号，并调控它的种种功能。钙离子在信号传导通路中发挥第二信使作用，在细胞收缩、运动、分泌和分裂等重要活动中，均需钙离子的参与及调节。钙离子的信使作用是通过其浓度的升高或降低来实现的。细胞内游离钙离子的浓度是10-8-10-7M，比细胞外钙离子浓度低104-105倍。当细胞受到特异性信号刺激后，细胞内钙库(内质网、肌浆网)的钙通道或质膜上的钙通道开放，使细胞内钙离子浓度快速升高，产生钙信号，进而使细胞内某些酶的活性和蛋白质功能发生改变，产生细胞效率。目前，最常用的检测钙离子浓度的方法是基于荧光探针检测，因此，需要确保待检测的细胞是不带荧光的。然而科学研究中，当探究钙调控相关蛋白功能时，需要对钙调控相关蛋白进行基因操作，如过表达或者干扰。此时，为了能直观地观察过表达或者干扰效果，科研工作者往往会加入荧光标签，而这会影响到后续钙离子浓度检测。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种重组慢病毒载体，能够检测钙离子浓度变化。本专利技术还提出了一种重组慢病毒。本专利技术还提出一种含有上述重组慢病毒载体的重组细胞。本专利技术还提出一种上述重组慢病毒载体的制备方法。本专利技术还提出一种上述重组慢病毒载体的应用。根据本专利技术的第一方面实施方式的重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包括插入有绿色荧光基因EGFP及钙调素依赖性蛋白激酶II(CAMKII)基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体选用Tet-On诱导表达慢病毒系统。根据本专利技术的一些实施方式，所述慢病毒载体包括pLVX-Tentone-puro。根据本专利技术的一些实施方式，所述钙调素依赖性蛋白激酶II(CAMKII)的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO.18所示。根据本专利技术的一些实施方式，所述绿色荧光基因EGFP的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO.19所示。根据本专利技术的第二方面实施方式的重组慢病毒，所述重组慢病毒采用上述重组慢病毒载体与包装质粒共转染哺乳细胞制备得到。根据本专利技术的一些实施方式，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。根据本专利技术的一些实施方式，所述哺乳细胞为293T细胞。根据本专利技术的一些实施方式，所述包装质粒包括psPAX2、pMD2.G载体。根据本专利技术的第三方面实施方式的含有上述重组慢病毒载体的重组细胞，所述重组细胞包含上述重组慢病毒载体和/或上述重组慢病毒的宿主细胞。根据本专利技术的一些实施方式，所述宿主细胞为人胶质母细胞瘤U87-MG细胞。根据本专利技术的第四方面实施方式的重组慢病毒载体的制备方法，所述方法如下步骤：将EGFP基因和CAMKII基因分别克隆至慢病毒载体中得到重组慢病毒载体。根据本专利技术的一些实施方式，所述重组载体的构建方法如下步骤：S1、取EGFP基因和CAMKII基因的上游引物和下游引物，及编码EGFP基因和CAMKII基因的模板，然后采用PCR扩增EGFP基因和CAMKII基因；S2、取pLVX-Tetone-puro慢病毒载体，将步骤S1扩增得到的EGFP基因和CAMKII基因克隆到所述pLVX-Tetone-puro慢病毒载体中，得到所述重组慢病毒载体。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中的EGFP基因上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中的CAMKII基因上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，EGFP基因的编码基因模板为含有人EGFP基因序列的质粒。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S1中，CAMKII基因的编码基因模板为含有人CAMKII基因序列的质粒。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中的pLVX-Tetone-puro慢病毒载体的引物核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示。根据本专利技术的一些实施方式，所述pLVX-Tetone-puro慢病毒载体引物核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示，使SEQIDNO.2序列与SEQIDNO.3序列完全反向互补，SEQIDNO.4序列与SEQIDNO.5序列完全反向互补；所述CAMKII基因正向引物核苷酸序列CAMKII-F如SEQIDNO.7所示，反向引物CAMKII-R核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其中，SEQIDNO.7的同源臂序列与SEQIDNO.6序列完全反向互补，SEQIDNO.8的同源臂序列与SEQIDNO.1序列完全反向互补；所述EGFP基因正向引物EGFP-F核苷酸序列如SEQIDNO.11所示、反向引物EGFP-R核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中，EGFP基因采用同源重组的方法，亚克隆至慢病毒载体TRE3GSpromoter下游的MCS区，使TRE3GSpromoter控制其表达。根据本专利技术的一些实施方式，所述步骤S2中，CAMKII基因采用反向分段扩增，无缝克隆将线性化载体与CAMKII基因片段重组，替换掉原慢病毒载体puro元件序列，完成亚克隆，由SV40promoter控制其表达。根据本专利技术的一些实施方式，所述CAMKII基因插到TRE3启动子后面，由dox来调控其表达。根据本专利技术的第五方面实施方式的上述重组慢病毒载体的应用，所述应用为将上述重组慢病毒载体用于细胞功能相关基因的荧光检测。根据本专利技术的一些实施方式，所述荧光检测由多西环素(doxycyclinehydrochloride，Dox)进行调控，当细胞内无Dox存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的EGFP荧光基因表达；当有Dox存在时，TetR与TetO分离，从而引起EGFP荧光基因的抑制解除，进而能够表达绿色荧光。根据本专利技术的一些实施方式，所述应用为将重组慢病毒载体用于钙调蛋白相关基因的检测。根据本专利技术的一些实施方式，所述应用为将重组慢病毒载体用于细胞内钙离子浓度的检测。一种检测细胞内钙离子浓度变化的方法，包括以下步骤：将上述重组慢病毒载体感染目的细胞，根据荧光强度的变化测定钙离子浓度的变化。根据本专利技术的一些实施方式，所述钙离子浓度变化检测采用细胞内钙离子检测试剂盒。根据本专利技术的一些实施方式，所述钙离子浓度变化检测可以采用荧光显微镜、酶标仪、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪。一种荧光标记可调节的慢病毒载体，所述载体制备方法包括如下步骤：将绿色荧光基因EGFP插本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组慢病毒载体，其特征在于：所述重组慢病毒载体包括插入有绿色荧光基因EGFP及钙调素依赖性蛋白激酶II基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体选用Tet-On诱导表达慢病毒系统。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组慢病毒载体，其特征在于：所述重组慢病毒载体包括插入有绿色荧光基因EGFP及钙调素依赖性蛋白激酶II基因的慢病毒载体，所述慢病毒载体选用Tet-On诱导表达慢病毒系统。


2.一种重组慢病毒，其特征在于：所述重组慢病毒采用如权利要求1所述的重组慢病毒载体与包装质粒共转染哺乳细胞制备得到。


3.根据权利要求2所述的重组慢病毒，其特征在于：所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。


4.一种重组细胞，其特征在于：所述重组细胞包括含有权利要求1所述的重组慢病毒载体和/或权利要求2或3所述的重组慢病毒的宿主细胞。


5.一种如权利要求1所述的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋明贵，刘军鹏，方娟，刘彩云，屈飞，
申请(专利权)人：湖南丰晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43