一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用，属于免疫细胞治疗领域。所述慢病毒冻存液的配方包括：人血浆白蛋白(HSA)注射液，0.9％生理盐水注射液；其中所述HAS的浓度包括10％，20％，30％，40％。

【技术实现步骤摘要】
一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用
本专利技术涉及免疫细胞治疗领域，具体地，涉及一种嵌合抗原受体(CAR-T)慢病毒冻存液及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptormodifiedTcells，CART)是通过基因修饰的手段，将一个人工合成的CAR分子(ChimericAntigenReceptor)表达在T细胞膜上，使T细胞以抗原抗体结合的方式识别并杀伤肿瘤细胞。CAR分子包括胞外的结合区域(能特异性识别靶抗原的单克隆抗体来源的单链抗体(scFv))、铰链区、跨膜区和胞内的信号段。这一技术有几个优势，例如，CAR蛋白对肿瘤表面的TAA(肿瘤相关抗原，tumorassociatedantigen)的识别是以一种MHC(majorhistocompatibilitycomplex)-非依赖性的方式进行的，因而CART细胞可以克服肿瘤细胞通过下调MHC分子逃脱免疫攻击，并且CAR识别没有MHC限制性，同一种CAR可以应用于不同的患者。另外，CAR蛋白可以识别细胞表面的任何类型的抗原，包括蛋白、糖类、糖脂，这样，相对于TCR只能识别MHC-肽段，CAR使T细胞能识别的肿瘤表面标志物的范围大大增加。目前CAR-T治疗主要是采取的携带有特异性针对肿瘤抗原的的CAR的慢病毒作为基因投递的载体，但是目前的一个瓶颈是，通过超离浓缩或者浓缩纯化后的慢病毒，用PBS或者生理盐水复溶后，新鲜慢病毒的感染T细胞的效率很高，但是慢病毒置于-80度保存，冻融后的慢病毒的感染效率约损失40％-60％，在CAR-T治疗产业中，急需一种高效、符合药典的慢病毒冻存液，相应的，本专利技术所述冻存液不局限于CAR-T治疗，可用于所有使用慢病毒作为基因治疗手段的生物技术。本专利技术以目前国内外技术成熟的CD19CAR-T为例，验证所开发的慢病毒冻存液对慢病毒颗粒的保护效率，其中CD19scFv采用经典的FMC63抗体，通过筛选不同浓度的HSA对慢病毒冻融后感染效率的比较，最终确定了最佳有效浓度成分为30-40％，为CAR-T治疗的产业化发展提供符合IND，NDA需要的慢病毒冻存液。
技术实现思路
本专利技术旨在解决目前基因治疗中，作为基因投递的载体-慢病毒在低温保存中不稳定，冻融后感染效率明显下降，导致治疗效果不稳定甚至失败的问题，本专利技术提供如下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种慢病毒冻存液的配方，包括如下体积分数的组分：10-40％人血浆白蛋白(HSA)，60-90％生理盐水注射液。第二方面，本专利技术提供了一种优化慢病毒冻存液配方的方法，配方成份单一，方法简单易操作，效果显著，制备成本较低，易于产业化生产。第三方面，本专利技术提供了一种如第一方面所述的慢病毒冻存液在制备CART细胞中的用途。第四方面，本专利技术提供了一种如上所述的慢病毒冻存液在制备CART细胞用于治疗肿瘤的药物中的用途。第五方面，本专利技术提供的慢病毒冻存液的配方不仅限于CAR-T治疗方法，也可用于所有基于慢病毒的基因治疗方法。本专利技术的优点将会在下面的说明书中部分阐明，可通过本专利技术实施例的实施而获知。附图说明图1为cryoS001-20％与两款商业化慢病毒冻存液三次冻融后的比较图2为.cryoS001-20％与两款商业化慢病毒冻存液三次冻融后CAR阳性率的比较图3为四种不同浓度的慢病毒冻存液三次冻融后流式检测的比较图4为四种不同浓度冻存液配方的慢病毒三次冻融的感染效率比较图5为四种不同浓度慢病毒冻存液三次冻融的稳定性比较图6四种不同浓度冻存液配方的慢病毒三次冻融的感染效率比较具体实施方式以下所述是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离专利技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本专利技术的保护范围。且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。下面将结合本专利技术具体实施例做进一步说明。实施例1：CD19CAR慢病毒载体构建FMC63scFv片段SEQIDNO：1，信号肽后对应的二代CAR铰链区、跨膜区、胞内区序列SEQIDNO：2，交由华大基因公司合成。分别得到两段合成基因后，进行CD19CAR的载体构建，首先通过PCR扩增并在两段序列的头尾分别加上酶切位点后，酶切、酶连得到SEQIDNO：3，将慢病毒载体pCDH-EF1a-T2A-puro和SEQIDNO：3，分别双酶切、T4DNA连接酶连接后，转化感受态细胞、挑单克隆，菌液测序无误后，大提质粒，得到序列正确的慢病毒载体pCDH-EF1a-CD19CAR质粒。实施例2：CD19CAR慢病毒制备慢病毒包装质粒混合物(包括PSPAX2和VSVG)与pCDH-EF1a-CD19CAR质粒按预优化的比例混合后，加入助转染试剂，室温下孵育30分钟。然后将转染混合物缓慢加入293T细胞(购自ATCC)。1-3天后收集培养基上清得到慢病毒粗液。在4℃下500g离心10min后收集上清液共180毫升。将180毫升平均分为6管，各30毫升一管置于超高速离心管中，配平后20000g超速离心2小时进行慢病毒浓缩。实施例3：慢病毒冻存液预实验本实施例将本专利技术的慢病毒冻存液(下文以cryoS001为代号)与2款商业化慢病毒冻存液(品牌1，宇玫博，货号UR40202，下文代号为UB；品牌2，安迪福诺，货号D022下文代号为ABP)对CD19CAR慢病毒的保护效率进行比较，以明确慢病毒冻存液的有效性。在上述实施例2中的分装的慢病毒超离结束后，小心弃去上清液，并用预冷的慢病毒冻存液重悬慢病毒颗粒：将两个超离管中的60毫升的慢病毒原液浓缩后弃去上清，各管用0.5毫升的UB或者ABP，或者cryoS001重悬，即超离浓缩的180毫升慢病毒原液分为三等分，每份60毫升，浓缩后每份用1毫升相应的慢病毒冻存液重悬，轻轻吹打混匀后用0.22μm的滤膜除菌过滤后分装为100μL/管后储存在-80℃冰箱。冻存24小时后，检测三种慢病毒冻存液保存的慢病毒的感染效率：1)第一天，接种1E+05个293T细胞于24孔板内，每孔1毫升含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/FBS培养基。2)第二天，配制3毫升DMEM/FBS+1/1000polybrane混合物，涡旋混匀后，将昨日接种的各孔293T细胞的培养基吸弃后，各孔加入0.5毫升的DMEM/FBS+1/1000polybrane混合物。将三种慢病毒在冰上冻融后，各取1-10μL加入各孔，每种病毒感染2个孔的细胞，剩余的慢病毒重新放回-80℃超低温冰箱冻存。3)第三天，各孔补加DMEM/FBS培养基1毫升继续培养。4)第五天，用2.5％胰酶将细胞自24孔板本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用，其特征在于：由以下组分制成，包含10％-40％人血浆白蛋白(HSA)，60％-90％的生理盐水注射液。/n

【技术特征摘要】
1.一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用，其特征在于：由以下组分制成，包含10％-40％人血浆白蛋白(HSA)，60％-90％的生理盐水注射液。


2.根据权利要求1所述的一种简单高效的慢病毒冻存液及其应用，其特征在于，所述慢病毒冻存液HAS的浓度包括10％，20％，30％，40％。


3.一种如权利要求1-2任一项所述的据权利要求1所述的简单高效的慢病毒冻存液及其应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冰，李治寰，李艳群，彭方理，卢佳豪，
申请(专利权)人：东莞清实生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44