软骨下骨细胞向关节软骨细胞直接转化的重编程诱导方案制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种经重编程软骨下骨成骨细胞向功能性关节软骨细胞直接转化的诱导方案，适用于关节软骨重度缺损的再生修复治疗。本发明专利技术的诱导方案包括：将Sox9、Sox5与Plagl1或与Sox8及Zcchc5基因导入软骨下骨细胞，获得软骨样细胞。

【技术实现步骤摘要】
软骨下骨细胞向关节软骨细胞直接转化的重编程诱导方案
本专利技术属于生物
，涉及细胞与分子生物学、真核细胞重编程、细胞转化与分化、组织再生修复，也涉及利用细胞重编程技术方案在关节软骨损伤治疗上的应用。
技术介绍
关节软骨组织(articularcartilage)具有精细的分层结构，含有不同功能的软骨细胞(chondrocyte)。中深层结构中缺乏血管、神经和淋巴管，软骨细胞数量稀少。虽然基质中主要包含胶原蛋白(collagen)、蛋白多糖(proteoglycan)和非胶原蛋白等成分，发挥缓冲和润滑作用，但缺乏自我更新能力(BhosaleandRichardson2008)。若关节活动造成高强度冲击和过度磨损，软骨发生严重损伤，软骨组织无法自我修复。随着我国人口老龄化的快速进程，关节软骨损伤的发病率逐年攀升；而全民健身运动的迅猛发展，也使得软骨病患人群呈现年轻化趋势。作为高发关节疾病的骨关节炎(osteoarthritis)，我国的患者数量目前已达总人口10％以上，其中出现症状者多已发生关节软骨缺损等病理学改变(BhosaleandRichardson2008)。由于临床干预有限，病程迁延不愈，创面及周边进一步磨损，逐步发展成为全层软骨缺损(full-thicknessdefect)，造成软骨下方骨板裸露(Frobell,Wirthetal.2010)，使关节运动受限加重，最终致残。软骨重度缺损患者只有通过全关节置换术才能改善生活质量、避免残疾(Juni,Reichenbachetal.2006)，但同时也需要经历可称之为最艰难的术后康复过程，还要面对假体维护及不可忽视的并发症等一系列问题，而对于广大老年患者来说，无疑需要承受更严峻的挑战。因此，开发风险低、安全性高的微创治疗方法具有十分重要的意义。目前，针对软骨缺损的再生修复治疗手段主要包括内源细胞招募和外源细胞移植两种方式。微骨折术(microfracture)通过骨面钻孔技术促进含有间充质干细胞的骨髓血渗出，填补缺损，修复损伤软骨。但该治疗存在术后易形成纤维软骨、有别于透明软骨的问题，削弱了关节功能修复作用(Oussedik,Tsitskarisetal.2015)。虽然采用非负重部位软骨组织的自体软骨细胞移植(autologouschondrocyteimplantation,ACIormatrix-inducedautologouschondrocyteimplantation,MACI)具有较好的透明软骨修复效果，但也存在无法避免的问题，如需要手术取材，自体软骨来源有限，体外培养中去分化现象以及供区术后并发症。由于关节软骨的分层结构特点，单纯移植分化成熟的软骨细胞，仍较难达到正常生理状态的修复水平。以间充质干细胞作为种子细胞近年来备受关注，成为基础和临床的研究热点(Harrell,Markovicetal.2019)。然而实际应用中，还面临着细胞获取、培养和保存等体外操作及精确调控细胞定向分化避免骨化和钙化等诸多问题，技术瓶颈有待突破。就软骨全层缺损的再生修复而言，软骨下骨细胞(subchondralbonecell)因具有以下独特优势，可能是潜在的种子细胞：(1)软骨细胞与软骨下骨细胞位置毗邻，暴露的软骨下骨细胞成为创面(lesion)；(2)软骨下骨板承载软骨下骨细胞，形成天然的细胞支架复合体(cell-scaffoldcomplex)；(3)两者皆为中胚层来源，属于同一谱系(lineage)；软骨细胞经软骨内骨化(endochondralossification)途径向成骨细胞转分化(chondrocyte-to-osteoblasttransdifferentiation)(Yang,Tsangetal.2014)；(4)软骨下骨细胞经骨骼干细胞终末分化，来源充足。由此，将软骨下骨细胞转变为具有修复功能的软骨细胞成为实现原位修复软骨全层缺损的首要关键。经外源过表达转录因子组合Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc可诱导成纤维细胞重编程(cellreprogramming)转变为诱导型多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSC)(TakahashiandYamanaka2006)，而基于此项技术，还可将其他成体细胞重编程转化为多潜能干细胞，其中包括由骨关节炎患者自体来源的软骨细胞、滑膜细胞向iPSC的直接诱导转化(Kim,Sonetal.2011,Wei,Zengetal.2012)，进而再分化为软骨细胞。由iPSC分化而来的软骨细胞可能比间充质干细胞显示更好的软骨基质形成能力(Ko,Kimetal.2014)。鉴于iPSC自身潜在的致瘤性风险使其在临床应用方面受到的制约，通过导入若干关键转录因子来诱导一类成体细胞直接转化(directconversion)为另一类成体细胞，可越过细胞去分化再定向分化的过程，避免经过iPSC阶段所带来的安全隐患。早在1987年曾经报道MyoD转录因子诱导成纤维细胞直接转换为肌细胞(Davis,Weintraubetal.1987)。近些年发现成纤维细胞经Gata4、Mef2c和Tbx5三因子诱导可直接转化为心肌样细胞(Ieda,Fuetal.2010)，软骨细胞也可由成纤维细胞、胎盘细胞、肌腱细胞直接重编程(directreprogramming)转化形成(Hiramatsu,Sasagawaetal.2011,Ishii,Kamietal.2012,Takimoto,Oroetal.2012)。由此可见，直接重编程技术可更直接利用成体细胞进行再生修复。针对软骨全层缺损的修复，创面底部暴露的软骨下骨细胞可直接用于向软骨细胞定向诱导转化的种子细胞。如果进行原位诱导，则只需要关节注射重编程因子即可实现，相当于极微创操作，患者近乎无痛，不但可弥补ACI/MACI疗法的不足，也开启利用天然支架移植技术的新模式。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种软骨下骨细胞向关节软骨细胞的直接转化路径和细胞重编程诱导方案。本专利技术所指的来源于软骨下骨板的特定骨组织细胞，包括成骨细胞、骨母细胞、骨细胞或破骨细胞，分布于关节软骨下骨板，通常由于位于其上方的关节软骨组织损伤或磨损而导致其裸露于关节表面。本专利技术所指的含有软骨下骨板的骨关节，包括膝关节、髋关节、椎关节、骶髂关节、肋椎关节、胸锁关节、肩锁关节、肩关节、肘关节、腕关节、足关节、手指关节。本专利技术所指的由软骨下骨细胞向关节软骨细胞的直接转化，包括由单一或多个转录因子作用于细胞内特定靶基因启动子区域，导致来源于软骨下骨板的特定骨组织细胞发生细胞直接重编程而失去原有特定类型细胞标志性功能与表型特征，同时定向转变成为另一特定类型并具有关节软骨细胞标志性功能与表型特征的关节软骨样细胞。本专利技术所指的关节软骨细胞，具有标志性功能与表型特征，包括表达高水平II型胶原蛋白、蛋白多糖，适量表达水平的IX和XI型胶原蛋白，呈现多边形铺路石状形态，不表达或低表达I型胶原蛋白，碱性磷酸酶，骨钙蛋白。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种由骨组织细胞向关节软骨细胞定向转化的重编程诱导方案，其特征在于，来源于软骨下骨板的特定骨组织细胞发生细胞直接重编程，失去原有特定类型细胞标志性功能与表型特征，同时定向转变成为另一特定类型并具有关节软骨细胞标志性功能与特征的关节软骨样细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种由骨组织细胞向关节软骨细胞定向转化的重编程诱导方案，其特征在于，来源于软骨下骨板的特定骨组织细胞发生细胞直接重编程，失去原有特定类型细胞标志性功能与表型特征，同时定向转变成为另一特定类型并具有关节软骨细胞标志性功能与特征的关节软骨样细胞。


2.根据权利要求1所述的重编程诱导方案，其特征在于，所述软骨下骨板的特定骨组织细胞发生细胞直接重编程，需将至少一个重编程因子转入软骨下骨板的骨组织细胞内，作用于细胞内特定靶基因启动子区域，诱导骨组织细胞向关节软骨样细胞的转化。


3.根据权利要求2所述的重编程诱导方案，其特征在于，重编程因子在骨组织细胞内表达至少一个重编程因子，诱导至少一个细胞内源基因及其产物的表达，形成至少一个稳定的、确定的、属于关节软骨细胞但应不足以维持原有骨组织细胞或诱导及促进第三类细胞的标志性功能与表型特征。


4.根据权利要求3所述的重编程诱导方案，其特征在于，重编程因子选自Sox9与Sox5、Sox6、Sox8中一个或多个因子组合，诱导及促进骨组织细胞定向转化成为软骨样细胞。


5.根据权利要求3所述的重编程诱导方案，其特征在于，所述重编程因子选自Sox9、Sox5与Plagl1的组合，或S...

【专利技术属性】
技术研发人员：竺青，李美含，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11