一种环形RNA敲低载体快速构建试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种环形RNA敲低载体快速构建试剂盒及其应用。本发明专利技术提供的试剂盒，通过调节试剂组分、配方和连接体系中空载体与gRNA的比例等，最终制成的试剂盒中共包含Linearized CasRx Vector、DNA Ligase Mix、10×Ligase Buffer、Nuclease‑free Water、U6Primer(10μM)、gRNA‑NC Vector等6种成分，采用本发明专利技术提供的试剂盒，可以快速高效构建含CasRx蛋白和gRNA表达的整合型载体，解决了现有技术中使用CRISPR/CasRx系统敲低环形RNA时碰到的质粒共转染效率低、敲低效果有限等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种环形RNA敲低载体快速构建试剂盒及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种环形RNA敲低载体快速构建试剂盒及其应用。
技术介绍
环形RNA(circularRNAs,circRNAs)是一类具有闭合环状结构的RNA分子，在多物种中广泛存在，比线性RNA更稳定。由于环形RNA与亲本基因来源于同一pre-mRNA，具有相同的外显子序列，只在反向剪切位点有特异序列，使得环形RNA敲除和敲低的实验设计存在难度高、受限多等问题。目前对环形RNA敲低研究中广泛应用的是siRNA/shRNA干扰，但环形RNA与亲本RNA有相同的序列，仅在环化位点处序列有特异性，很容易非特异靶向亲本RNA或其他RNA。siRNA靶标设计难度也很高，只能限定长度19～21nt且靶向反向剪切位点，对序列要求高，设计受限，可选择性低，部分序列特殊的环形RNA甚至无法设计出一条siRNA。因此使用siRNA/shRNA敲低环形RNA经常碰到干扰效率低、脱靶和潜在脱靶或错误靶向亲本基因mRNA等结果，直接影响实验结果的可靠性。另外也有使用ASO(反义寡核苷酸)干扰circRNA的，存在的问题是ASO主要在细胞核内发挥作用，难以适用于大部分定位于细胞质的circRNA。而针对反向剪切位点设计靶标的限制与siRNA基本相同。CRISPR-Cas13系统是以Cas13酶作为Cas核酸酶的CRISPR子系统，仅靶向RNA而不靶向DNA，具有靶向效率高、酶切能力优异的特点。目前已经发现四类Cas13蛋白，分别为Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d，具有RNA酶活性，精确切割RNA，而且切割位点具有序列依赖性和结构依赖性。研究(ScreeningforfunctionalcircularRNAsusingtheCRISPR–Cas13system.https://doi.org/10.1038/s41592-020-01011-4.)利用CRISPR/RfxCas13d(CasRx)系统成功地批量化敲低了环形RNA，为环形RNA敲低验证了一种新的技术选择。但该研究中CRISPR/CasRx(RfxCas13d)系统是设计为CasRx(RfxCas13d)蛋白表达载体和gRNA表达载体两个质粒共同使用的，且CasRx(RfxCas13d)蛋白表达载体的序列构建为RfxCas13d-mCherry-Flag，增加了mCherry蛋白与CasRx融合表达以保持CasRx的稳定，因此CasRx蛋白表达载体构建步骤繁琐且序列较长，导致质粒长度过大。使用时需要将CasRx蛋白表达载体和gRNA表达载体两个质粒共转染，因为涉及两个质粒共转染，且质粒较大，因此很容易导致转染效率偏低，表达量有限，从而影响敲低实验效果。此外利用CasRx敲低其他RNA的研究中，也是CasRx蛋白表达载体和gRNA表达载体两个质粒共同使用，同样容易碰到转染效率低和敲低实验效果有限的问题。因此需要开发一种能快速构建CRISPR/CasRx整合型载体的试剂盒用于环形RNA敲低研究。
技术实现思路
针对现有技术普遍存在的缺陷，本专利技术创造性地提供了一种环形RNA敲低载体快速构建试剂盒及其应用。采用本专利技术提供的试剂盒可以快速高效构建含CasRx蛋白和gRNA表达的整合型载体，解决了现有技术中使用CRISPR/CasRx系统敲低环形RNA时碰到的质粒共转染效率低、敲低效果有限等问题。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种环形RNA敲低载体快速构建的试剂盒，包含LinearizedCasRxVector、DNALigaseMix、10×LigaseBuffer、Nuclease-freeWater、10μM的U6Primer、gRNA-NCVector共6种成分。本专利技术提供的试剂盒的试验流程图如图1所示。优选地，所述LinearizedCasRxVector选自LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1、LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1、LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1中的一个或多个。优选地，所述LinearizedCasRxVector的序列组成为TTTT-U6terminator-CMVpromoter-CasRx-Flag-EGFP-IRES-PuroR-WPRE-backbone-U6promoter-CasRxDR30-AAAC；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1为慢病毒载体骨架；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1为ssAAV载体骨架；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1中CasRx的5’和3’末端分别添加有核定位信号NLS序列；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1的核苷酸序列如SEQIDNO.1；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1的核苷酸序列如SEQIDNO.2；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1的核苷酸序列如SEQIDNO.3；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1的核苷酸序列如SEQIDNO.4。优选地，所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1为pCasRx-L0经BpiI双酶切线性化后回收制备而成；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1为pCasRxN-L0经BpiI双酶切线性化后回收制备而成；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1为pCasRx-A0经BpiI双酶切线性化后回收制备而成；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1为pCasRxN-A0经BpiI双酶切线性化后回收制备而成。优选地，所述DNALigaseMix包含500U/μL的T4DNAligase、pH为7.5，20mM的Tris-HCl、50mMKCl、1mMDTT、0.1mMEDTA和50％甘油；所述10×LigaseBuffer包含pH为7.8，400mMTris-HCl、100mMMgCl2、100mMDTT、5mMATP和25％PEG4000；所述10μM的U6Primer为合成的U6引物，核苷酸序列信息如SEQIDNO.5所示，并经PAGE纯化，使用时Nuclease-freeWater稀释。A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环形RNA敲低载体快速构建的试剂盒，其特征在于，包含Linearized CasRxVector、DNA Ligase Mix、10×Ligase Buffer、Nuclease-free Water、10μM的U6Primer、gRNA-NC Vector共6种成分。/n

【技术特征摘要】
1.一种环形RNA敲低载体快速构建的试剂盒，其特征在于，包含LinearizedCasRxVector、DNALigaseMix、10×LigaseBuffer、Nuclease-freeWater、10μM的U6Primer、gRNA-NCVector共6种成分。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LinearizedCasRxVector选自LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1；LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1；LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1中的一个或多个。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LinearizedCasRxVector的序列组成为TTTT-U6
terminator-CMVpromoter-CasRx-Flag-EGFP-IRES-PuroR-WPRE-backbone-U6promoter-CasRxDR30-AAAC；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1为慢病毒载体骨架；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1为ssAAV载体骨架；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1和LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1中CasRx的5’和3’末端分别添加有核定位信号NLS序列；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1的核苷酸序列如SEQIDNO.1；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1的核苷酸序列如SEQIDNO.2；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1的核苷酸序列如SEQIDNO.3；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-A1的核苷酸序列如SEQIDNO.4。


4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-L1为pCasRx-L0经BpiI双酶切线性化后回收制备而成；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRxN-L1为pCasRxN-L0经BpiI双酶切线性化后回收制备而成；所述LinearizedCasRxVector，FrompCasRx-A1为pCasRx-A0...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明，李自强，刘景磊，黄宁宁，
申请(专利权)人：广州吉赛医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44