一株重组新城疫病毒弱疫苗株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一株重组新城疫病毒弱疫苗株及其构建方法，属于弱疫苗株构建技术领域。本发明专利技术的重组新城疫病毒弱疫苗株的构建方法，是将VII型新城疫病毒的NP基因替换成II型新城疫病毒NP基因序列，并将F基因的第112,115,117位氨基酸突变为G、E、L，通过反向遗传操作构建而成。本发明专利技术的重组新城疫病毒弱疫苗株静脉致病指数为0，脑内致病指数为0.38，符合低致死的生物学特征。采用该重组病毒液免疫鸡群具有较高的效价，免疫鸡的HI效价均介于6log2‑7log2，因而，不仅能够诱导鸡产生免疫应答且具有良好的安全性，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一株重组新城疫病毒弱疫苗株及其构建方法
本专利技术属于弱疫苗株构建
，具体涉及一株重组新城疫病毒弱疫苗株及其构建方法。
技术介绍
新城疫是由新城疫病毒引起的一种高度接触性、急性传染病，我国将其列为一类动物疫病。由于我国鸡群新城疫病毒感染率较高，所以会多次接种疫苗。目前我国市面上最常使用的多为新城疫基因II型疫苗，而目前我国新城疫病毒的主要流行株为新城疫基因VII型，导致新城疫基因II型疫苗无法高效预防新城疫基因VII型毒株，导致我国近年来鸡群中非典型新城疫频发。所以，有效控制基因VII型新城疫病毒爆发对我国新城疫防控有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一株重组新城疫病毒弱疫苗株及其构建方法；本专利技术对F基因及NP基因序列进行编辑，将NP基因替换成II型新城疫病毒NP基因序列，并将F基因的第112,115,117位氨基酸突变为G、E、L，将毒力减弱；专利技术了新城疫基因VII型疫苗株，解决了市场现有疫苗与流行株不匹配的根本问题，同时对II型引起的新城疫有预防保护作用。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一株重组新城疫病毒弱疫苗株的构建方法，是将VII型新城疫病毒的NP基因替换成II型新城疫病毒NP基因序列，并将F基因的第112,115,117位氨基酸突变为G、E、L，通过反向遗传操作构建而成。在上述方案的基础上，所述反向遗传操作为：将构建的重组新城疫病毒的全基因重组载体与分别包含NP、P、L基因的三个辅助重组质粒转染能够表达T7RNA聚合酶的细胞系；经培养获得重组新城疫病毒弱疫苗株。在上述方案的基础上，所述能够表达T7RNA聚合酶的细胞系是由T7RNA聚合酶基因与PCI-neo载体连接后，转染BHK-21细胞获得的。上述方法构建的重组新城疫病毒弱疫苗株，于2021年01月02日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏编号为CCTCCNO:V202108，地址为中国.武汉.武汉大学。上述重组新城疫病毒弱疫苗株在制备疫苗中的应用。在上述方案的基础上，所述疫苗对VII型和II型引起的新城疫具有预防保护作用。本专利技术技术方案的优点：本专利技术的重组新城疫病毒弱疫苗株静脉致病指数为0，脑内致病指数为0.38，符合低致死的生物学特征。采用该重组病毒液免疫鸡群具有较高的效价，免疫鸡的HI效价均介于6log2-7log2，因而，不仅能够诱导鸡产生免疫应答且具有良好的安全性，具有广阔的应用前景。具体实施方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1重组新城疫病毒弱疫苗株的构建方法(1)获得含有T7RNA聚合酶基因的重组质粒以BL21菌株基因组DNA为模板，采用以下引物，扩增T7RNA聚合酶基因：T7-F：5’-CTCGAGCCACCATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGAC-3’(XhoI酶切位点)(SEQIDNO:1)；T7-R：5’-TCTAGATTACGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGT-3’(XbaI酶切位点)(SEQIDNO:2)；扩增产物片段大小约2.6kb。使用XhoI、XbaI进行双酶切，回收T7RNA聚合酶基因的目的片段。将PCI-neo载体进行双酶切(XhoI、XbaI)，胶回阳性片段，与T7RNA聚合酶基因片段用T4连接酶进行连接、转化，质粒小提后进行PCR及酶切鉴定，选阳性质粒送生工测序，鉴定正确的即为携带T7RNA聚合酶基因的重组质粒。(2)表达T7RNA聚合酶细胞系的建立用含6％胎牛血清的DMEM培养BHK-21细胞，接种6孔板，待细胞长至70％左右时按照脂质体转染试剂盒说明书，将步骤(1)中携带T7RNA聚合酶基因的重组质粒对BHK-21细胞进行转染。转染24小时后，换成含700ng/mL的G418培养基加压筛选。传至25代时提取细胞RNA，反转录后进行RTPCR鉴定。最终获得可稳定持续表达T7RNA聚合酶基因的BHK-21细胞系。(3)新城疫载体的构建提取VII型新城疫病毒的RNA，设计引物进行RT-PCR，分成8段通过酶切构建重组病毒，上游加入T7起始序列，下游加入T7终止序列。将重组病毒序列连入PBR322载体，构建重组质粒。重组病毒引物(含酶切位点)如下：H71-1F：GGAATTCTAATACGACTCACTATAGACCAAACAGAGAATCCGTAAG(SEQIDNO:3)H71-1R：CGACGCGTGCCGATTTCTTCAGATACTC(SEQIDNO:4)H71-2F：AAGGCCTGCGGAACCCTAGAGTATAAAGTG(SEQIDNO:5)H71-2R：CGACGCGTGTATTGCTATTTGGTTGCTTGTTCC(SEQIDNO:6)H71-3F：CAGATGAGAGCCACCACGAGAGC(SEQIDNO:7)H71-3R：CGACGCGTGAGGATCTCTACTAGTAAGGGAACG(SEQIDNO:8)H71-4F：AAGGCCTGTCGACAATCCGCCCAGAGCCCAAG(SEQIDNO:9)H71-4R：GTTTAAACATGGATTTGCGGGGGGGGGC(SEQIDNO:10)H71-5F：GTTTAAACACCCCAAGCAACAGCCCTCTC(SEQIDNO:11)H71-5R：GACATCCCTTCTCGGTACCACAGTC(SEQIDNO:12)H71-6F：GAGTAGAGTATGCTCAGGCTCAGGG(SEQIDNO:13)H71-6R：GTGTCGGGCGGATTGTCGACG(SEQIDNO:14)H71-7F：GTTCAAGCAGCACCAAGGCAGC(SEQIDNO:15)H71-7R：GTTCCGGGCATAATCTGCTAGCG(SEQIDNO:16)H71-8F：CTCGCTGACGCTAGCAGATTATG(SEQIDNO:17)H71-8R：CGACGCGTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGACCAAACAGAGATTTGGTGAATG(SEQIDNO:18)其中，NP基因替换为II型新城疫NP基因；该II型新城疫NP基因通过基因合成得到，设计引物F：GGAATTCTAATACGACTCACTATAG(SEQIDNO:19)，R：GTCGACGAACCGAGCTGTGCC(SEQIDNO:20)进行PCR，大小约为1.7kb；通过酶切连入载体，酶切位点为EcoRI和SalI。F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株重组新城疫病毒弱疫苗株的构建方法，其特征在于，将VII型新城疫病毒的NP基因替换成II型新城疫病毒NP基因序列，并将F基因的第112,115,117位氨基酸突变为G、E、L，通过反向遗传操作构建而成。/n

【技术特征摘要】
1.一株重组新城疫病毒弱疫苗株的构建方法，其特征在于，将VII型新城疫病毒的NP基因替换成II型新城疫病毒NP基因序列，并将F基因的第112,115,117位氨基酸突变为G、E、L，通过反向遗传操作构建而成。


2.根据权利要求1所述重组新城疫病毒弱疫苗株的构建方法，其特征在于，所述反向遗传操作为：将构建的重组新城疫病毒的全基因重组载体与分别包含NP、P、L基因的三个辅助重组质粒转染能够表达T7RNA聚合酶的细胞系；经培养获得重组新城疫病毒弱疫苗株。


3.根据权利要求2所述重组新城疫病毒弱疫苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：马凤龙，李明义，衣春霖，刘刚，张新玲，王宗科，李易，
申请(专利权)人：青岛海华生物医药技术有限公司，青岛海润检测股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37