抗猪流行性腹泻的鼻内载体疫苗制造技术

本发明专利技术是关于(载体)疫苗的领域，且尤其是关于包含编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原的异源核苷酸序列的犬瘟热病毒(CDV)载体。该PEDV抗原优选是PEDV刺突(S)蛋白。本发明专利技术的该病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗以用于对母猪进行鼻内免疫，且由此保护由该等母猪哺育的仔猪对抗与PEDV感染相关的临床征象。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗猪流行性腹泻的鼻内载体疫苗
本专利技术是关于(载体)疫苗的领域。本专利技术的病毒载体可用于产生用于在猪体内诱导抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的免疫反应的免疫原性组合物或疫苗。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒是在猪中引起急性腹泻、呕吐及脱水的包膜的正义单链RNA病毒。在三周龄及更年轻的猪中，一旦PEDV感染后24小时即可观察到临床征象(包括急性水样、腹泻、呕吐及脱水)，导致高达100％死亡率。此外，受PEDV感染的动物的肠道的总体及组织学变化可导致小肠内出现严重的病理病灶。尽管仅报导了PEDV的一种血清型，但对S基因的系统发育研究显示，PEDV可在遗传上分为2组：基因组1(G1；典型)及基因组2(G2；地区流行性或大流行)。每个基因组可进一步分为亚组(1a及1b；2a及2b)。G1a包括原型PEDV株CV777、疫苗株及其他适应于细胞培养的毒株，而G1b包含在中国首次被鉴别到且稍后在美国、韩国及欧洲被鉴别到的新的变体。G2包含全球野外分离株，其进一步分簇为2a及2b亚组(G2a及G2b)，分别导致先前在亚洲的局部流行性疾病暴发及最近在北美及亚洲的大流行性疾病暴发。PEDV是α冠状病毒属冠状病毒亚科的成员。PEDV是处理约28kb的正义单链RNA基因组且具有5'帽及3'聚腺苷酸化尾的包膜病毒(Pensaert及DeBouckP.1978)。基因组包含5'非翻译区(UTR)、3'UTR及至少七个编码四种结构蛋白(刺突(S)、包膜(E)、膜(M)及核衣壳(N))及三种非结构蛋白(复制酶1a及1b及ORF3)的开放阅读框(ORF)；该等以顺序5'-复制酶(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3'排列在基因组上(OldhamJ.1972；及Bridgen等人1993)。PEDVS蛋白是I型糖蛋白，其中(G2bPEDV的)S蛋白由1,383个氨基酸(aa)构成。S蛋白基于其与其他冠状病毒的S蛋白的同源性，可分为S1(例如1-789aa)及S2(例如790-1,383aa)结构域。冠状病毒中的S蛋白是表面抗原，其中其在调节与宿主细胞受体糖蛋白的相互作用以介导病毒进入及刺激天然宿主中之中和抗体的诱导中起作用。因此，S糖蛋白是抗PEDV的有效疫苗的研发的主要目标。PEDV在欧洲首次被鉴别到，但在包括韩国、中国、日本、菲律宾及泰国在内的许多亚洲国家中已经变得愈来愈成问题。自2013年以来，PEDV出现在美国，且PEDV感染的经济影响已经很大。因此，继续需要研发能够保护猪免于与PEDV相关的疾病的疫苗。WO2017165366(A1)阐述表达PEDVS蛋白的羊口疮病毒(ORFV)载体在肌内施用时在猪中诱导血清IgG、IgA及中和抗体反应(WO2017165366(A1)的第[0172]段)。此外，显示此载体对怀孕小母猪的肌内施用导致该等小母猪所生的仔猪的被动免疫(Joshi等人ArchVirol.163(9):2327-2335(2018)。然而，由于使用习用的针及注射器重复进行肌内注射可能对动物产生应力，因此期望可(例如)作为鼻喷雾经由鼻内途径施用的抗猪流行性腹泻(PED)的载体疫苗。
技术实现思路
通过申请专利范围中表征的说明及实施例来实现对上述技术问题的解决方案。因此，本专利技术在其不同方面中根据申请专利范围执行。本专利技术基于以下惊人的发现：在犬瘟热病毒(CDV)病毒基因组的磷蛋白(P)基因与基质蛋白(M)之间插入编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)刺突(S)蛋白的异源核苷酸序列，可产生可用于对母猪进行鼻内免疫且由此保护由该等母猪哺育的仔猪对抗与PEDV感染相关的临床征象的CDV载体。在第一方面中，本专利技术因此提供包含所关注的异源核苷酸序列的犬瘟热病毒(CDV)载体，其中所关注的该异源核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原。在具体方面中，本专利技术使用CDV的莱德利(Lederle)疫苗株(以登录号VR-128保藏在ATCC)作为主链(由基因库登录号DQ903854.1、AY288311或AY286480代表的基因型)或与其至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列，例如来自由其额外传代衍生的病毒(例如犬犬瘟热病毒，莱德利无毒力，目录号NR-3845，BiodefenseandEmergingInfectionsResearchResourcesRepository,P.O.Box4137,Manassas,VA20108-4137,USA)。本专利技术的载体具体而言可用于哺乳动物、具体而言猪的疫苗接种。此外，本专利技术涵盖用于在猪中诱导抗猪流行性腹泻病毒的免疫反应的载体。因此，在本专利技术的上下文中，亦提供CDV载体，其包含具有编码猪流行性腹泻病毒的刺突蛋白的异源RNA序列的表达盒。本专利技术进一步是关于包含该等载体的哺乳动物宿主细胞及使用该等宿主细胞生成载体疫苗的方法、以及包含本专利技术的CDV载体的免疫原性组合物及疫苗。具体实施方式本专利技术解决了先前技术中固有的问题，且提供最先进的明显进步。在本专利技术的上下文中，向怀孕母猪鼻内施用编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)的刺突蛋白的CDV载体，其随后经由摄入抗体阳性初乳引起仔猪的被动免疫，如由在用PEDV攻击后发病率或临床征象的严重程度、致死率及病毒脱落降低可见。因此，本专利技术提供犬瘟热病毒载体，本文中亦称为“本专利技术的CDV载体”，其中该载体包含所关注的异源核苷酸序列，且其中该所关注的异源核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原。如本文提及的所关注的异源核苷酸序列具体而言是所关注的异源RNA序列。优选地，该PEDV抗原是选自由以下组成的群：PEDV刺突(S)蛋白及PEDV核蛋白(N蛋白)，其中PEDV刺突蛋白尤佳。优选地，该PEDV抗原因此是PEDVS蛋白，且其中该PEDVS蛋白优选包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。在一个优选方面中，该PEDVS蛋白因此包含与SEQIDNO:1的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。在另一优选方面中，该PEDVS蛋白因此包含与SEQIDNO:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。作为另一优选选择，该PEDV抗原是PEDVS蛋白，且其中该PEDVS蛋白优选包含与SEQIDNO:16或SEQIDNO:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。在一个优选方面中，该PEDVS蛋白因此包含与S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬瘟热病毒(CDV)载体，其包含所关注的异源核苷酸序列，其中所述所关注的异源核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180920 EP 18195788.7;20190328 EP 19165985.31.一种犬瘟热病毒(CDV)载体，其包含所关注的异源核苷酸序列，其中所述所关注的异源核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原。


2.如权利要求1的CDV载体，其中所述PEDV抗原是PEDVS蛋白，且其中所述PEDVS蛋白优选地包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列或由其组成。


3.如权利要求1或2的CDV载体，其中所述PEDV抗原是PEDVS蛋白，且其中所述PEDVS蛋白优选地包含与SEQIDNO:16或SEQIDNO:17的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列或由其组成。


4.如权利要求1-3中任一项的CDV载体，其中所述所关注的异源核苷酸序列编码PEDVS蛋白，且其中所述所关注的异源核苷酸序列优选是与SEQIDNO:3至5中的任一者的序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的RNA序列。


5.如权利要求1-4中任一项的CDV载体，其中
-所述所关注的异源核苷酸序列位于CDV的P基因与M基因之间；和/或
-所述所关注的异源核苷酸序列是所关注的异源RNA序列，且其中所述异源RNA序列可操作地连接至CDV的位于所述异源RNA序列的3′方向上的基因起始(GS)序列和/或基因组启动子。


6.如权利要求1-5中任一项的CDV载体，其包含与SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的RNA序列。


7.如权利要求1-6中任一项的CDV载体，其包含与SEQIDNO:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的RNA序列。


8.如权利要求7的CDV载体，其进一步包含：
-RNA序列，所述RNA序列包含与SEQIDNO:9的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的RNA序列或由其组成，且其中所述RNA序列侧接与SEQIDNO:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的RNA序列的5′端，
和/或
-RNA序列，所述RNA序列包含与SEQIDNO:10的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的RNA序列或由其组成，且其中所述RNA序列侧接与SEQIDNO:8的序列至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的RNA序列的3′端。


9.一种核酸分子，其编码如前述任一项权利要求的CDV载体，且其中该核酸分子优选是DNA分子。


10.如权利要求9的核酸分子，其中该所述分子包含编码PEDV刺突(S)蛋白的DNA序列，且其中该序列优选是与SEQIDNO:11或SEQIDNO:12的序列至少70％、80％、85％、90...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·尼科林，A·加列，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE