一种十字花科假单胞菌PL9及其应用制造技术

本发明专利技术属于菌株的筛选和应用领域，本发明专利技术提供了一种十字花科假单胞菌PL9及其应用。本发明专利技术提供的十字花科假单胞菌PL9，拉丁文为Pseudomonasbrassicacearum，该菌具有溶解无机磷的能力。其溶磷圈直径和菌落直径的比值(D/d)达到2.3，从磷酸三钙中活化出来的速效磷含量达到4.38mg/L，活化率达到69.60％。

【技术实现步骤摘要】
一种十字花科假单胞菌PL9及其应用
本专利技术涉及菌株的筛选和应用的
，尤其涉及一种十字花科假单胞菌PL9及其应用。
技术介绍
据报道，我国有2/3的土壤缺磷，缺磷的主要原因是由于土壤有效磷含量不足，施入土壤的磷肥，只是部分被农作物吸收利用，而相当一部分与土壤胶体或金属离子发生反应形成难以被植物利用的形态，从而降低了磷的利用率。土壤中存在着许多具有不同解磷能力的微生物，一般将具有溶解无机磷酸盐能力的微生物称作解无机磷微生物，它们能够促进磷灰石[Ca3(PO4)2]等难溶性磷酸盐释放出可溶性磷，提高土壤中可溶性磷的含量，从而可明显地促进农作物的生长，使其根系发达，增强农作物的抗病能力。因此，对解磷微生物菌剂及其应用的研究，已经成为当前土壤微生物修复研究的热点，对提高土壤肥力和促进农作物增产具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有溶解无机磷能力的菌株。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一株十字花科假单胞菌PL9，拉丁文为Pseudomonasbrassicacearum。本专利技术还提供了所述十字花科假单胞菌PL9溶解无机磷的应用。本专利技术还提供了一种溶解无机磷的方法，包括如下步骤：(1)将十字花科假单胞菌PL9进行扩大培养，制得种子液；(2)取所述种子液的菌体，用质量分数为0.8～0.9％的氯化钠溶液定容至15～20mL，得到菌液；(3)将所述菌液接种到无机磷液体培养基中溶解无机磷。优选的，所述扩大培养用的培养基为LB液体培养基。优选的，所述扩大培养的条件为36～38℃、150～200r/min振荡培养18～22h。优选的，所述菌液的浓度为106～108cfu/mL。优选的，步骤(2)中所述菌体通过将所述种子液离心得到，所述离心是在4800～5200r/min下离心2～5min。优选的，所述菌液与无机磷液体培养基的体积比为1～5:50。优选的，所述溶解无机磷的条件为36～38℃、150～200r/min振荡培养8～15h。本专利技术提供具有溶解无机磷作用的十字花科假单胞菌PL9，该菌株具有较强的溶解无机磷的能力。其溶磷圈直径和菌落直径的比值(D/d)达到2.3，从磷酸三钙中活化出来的速效磷含量达到4.38mg/L，活化率达到69.60％。附图说明图1为菌株PL9在无机磷培养基上形成的溶磷圈。具体实施方式本专利技术还提供了一种溶解无机磷的方法，包括如下步骤：(1)将十字花科假单胞菌PL9进行扩大培养，制得种子液；(2)取所述种子液的菌体，用质量分数为0.8～0.9％的氯化钠溶液定容至15～20mL，得到菌液；(3)将所述菌液接种到无机磷液体培养基中溶解无机磷。本专利技术是利用十字花科假单胞菌PL9对无机磷进行溶解，首先将十字花科假单胞菌PL9进行扩大培养，制得种子液。在本专利技术中，所述扩大培养所用培养基优选为LB液体培养基。所述LB液体培养基的配方优选为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，加蒸馏水至1000mL，pH7.0～7.2。在本专利技术中，所述扩大培养的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃。在本专利技术中，所述扩大培养优选为振荡培养，所述振荡的转速优选为150～200r/min，进一步优选为180r/min。在本专利技术中，所述扩大培养的时间优选为18～22h，进一步优选为20h。在本专利技术中，所述种子液的OD值优选为0.5～0.8，进一步优选为0.6。培养得到种子液后，取所述种子液的菌体，用质量分数为0.8～0.9％的氯化钠溶液定容至15～20mL，得到菌液。在本专利技术中，从所述种子液中得到菌体的方法优选为离心。在本专利技术中，所述离心的转速优选为4800～5200r/min，进一步优选为5000r/min。在本专利技术中，所述离心的时间优选为2～5min，进一步优选为3min。在本专利技术中，获得菌体后，还优选用0.85％的氯化钠溶液清洗菌体3次。在本专利技术中，进一步优选用0.85％的氯化钠溶液将菌体定容至15mL。在本专利技术中，所述菌液的浓度优选为106～108cfu/mL，进一步优选为107cfu/mL。将所述菌液接种到无机磷液体培养基中溶解无机磷。在本专利技术中，所述无机磷液体培养基的配方优选为：葡萄糖10g/L、磷酸三钙5g/L、六水氯化镁5g/L、七水硫酸镁0.25g/L、氯化钾0.2g/L、硫酸铵0.1g/L、蒸馏水1000mL，pH7.0。在本专利技术中，所述菌液与无机磷液体培养基的体积比优选为1～5:50，进一步优选为2:50。在本专利技术中，所述溶解无机磷的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃；优选振荡培养的转速为150～200r/min，进一步优选为180r/min；时间优选为8～15h，进一步优选为12h。下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。实施例1样品的采集、菌株的分离和纯化(1)样品的采集本专利技术提供的十字花科假单胞菌PL9来自野生牡丹-黄牡丹根际土壤。采集方法如下：先将土壤表层可见杂物去除，根据五点采样法，在距离植株10cm处利用土钻收集根际土壤，装入无菌袋中，置于冰盒内保存。到达实验室后用毛刷将附着在根系上的土壤刷下来，收集后混匀，放于4℃冰箱中冷藏保存、备用。(2)菌株的分离在超净工作台中，用毛刷将附着在根系上的土壤刷下，收集后混匀。然后称取5g土壤于无菌离心管中，用无菌水定容至50mL，振荡20min，然后按照10倍梯度依次用无菌水进行稀释，用移液枪吸取10-6、10-5、10-4三个稀释度样品各0.1mL，均匀涂布于无机磷固体培养基中，每个梯度重复3次，最后在28℃恒温箱中倒置培养，并观察菌落生长状况及透明圈产生情况。(3)菌株的纯化待无机磷固体培养基中产生溶磷圈后，用接种环挑取具有溶磷圈且未发生重叠的菌落，在新的无机磷固体培养基按Z字形划线纯化，之后在28℃恒温箱中倒置培养，得到纯菌株PL9，将其保存在4℃冰箱中。在本实施例中，所述无机磷固体培养基的配方为：葡萄糖10g/L、磷酸三钙5g/L、六水氯化镁5g/L、七水硫酸镁0.25g/L、氯化钾0.2g/L、硫酸铵0.1g/L、琼脂粉15g/L、蒸馏水1000mL，pH7.0。实施例2菌株的鉴定采用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒(Axygen，USA)提取菌株PL9的基因组DNA，具体步骤按照操作说明进行。利用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)对基因组DNA进行扩增，得到PCR产物。PCR产物用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，具体步骤按照操作说明进行。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株十字花科假单胞菌PL9，拉丁文为Pseudomonas brassicacearum。/n

【技术特征摘要】
1.一株十字花科假单胞菌PL9，拉丁文为Pseudomonasbrassicacearum。


2.一种权利要求1所述的十字花科假单胞菌PL9溶解无机磷的应用。


3.一种溶解无机磷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将十字花科假单胞菌PL9进行扩大培养，制得种子液；
(2)取所述种子液中的菌体，用质量分数为0.8～0.9％的氯化钠溶液定容至15～20mL，得到菌液；
(3)将所述菌液接种到无机磷液体培养基中溶解无机磷。


4.如权利要求3所述的一种溶解无机磷的方法，其特征在于，所述扩大培养所用培养基为LB液体培养基。


5.如权利要求3所述的一种溶解无机磷的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭大龙，郭丽丽，侯小改，宋鹏，牛童非，李昱莹，刘曙光，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41