一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13及应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3‑13及应用。通过将本申请的菌株用于解有机磷的试验中，发现此菌株可以从植酸钙中活化出的速效磷含量为5.30mg/L，对植酸钙的活化率达到62.14％。可见降解效果很好。

【技术实现步骤摘要】
一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13及应用
本专利技术涉及微生物
，尤其涉及一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13及应用。
技术介绍
解有机磷细菌是指能够分解有机磷化合物的细菌，其种类多种多样，不同细菌的解磷机制各有不同。微生物对有机磷溶解和矿化的机制一般认为与其分泌的酶有关，解有机磷细菌通过分泌胞外磷酸酶对有机磷进行酶解。当磷元素成为微生物生长的主要限制因子时，微生物就会释放出胞外磷酸酶，将有机磷水解为有效磷，与此同时，微生物胞内碱性磷酸酶会被诱导合成并不断积累。目前，国内对于解有机磷细菌的研究大多都来源于陆地土壤，因此对有机磷降解机制的研究也就集中于土壤微生物来源。而对于牡丹根际解有机磷的细菌还未见报道。因此，如何提供一种牡丹根际解有机磷细菌的方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种植物根际解有机磷的细菌。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13，所述巨大芽孢杆菌的拉丁文为Bacillusmegaterium，16SrDNA的序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌在解有机磷方面的应用。作为优选，所述有机磷为植酸钙。本专利技术还提供了一种解有机磷的方法，包括如下步骤：(1)将巨大芽孢杆菌FD3-13进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷的菌株；(2)将步骤(1)得到的扩大培养的解有机磷的菌株进行处理，制成解有机磷的菌液；(3)将解有机磷的菌液接种于有机磷液体培养基中进行培养，降解有机磷。作为优选，步骤(1)中扩大培养的培养基为LB培养基。作为优选，步骤(1)中扩大培养的条件为：培养温度为36～38℃，培养转速为160～200r/min，培养时间为18～22h。作为优选，步骤(2)中制成解有机磷的菌液的溶剂为质量分数为0.8～0.9％的NaCl溶液。作为优选，步骤(3)中的培养条件为：培养温度为35～39℃，培养转速为160～200r/min，培养时间为10～14h。本专利技术提供的菌株是从三年生油用牡丹根际中分离筛选得到的，丰富了解有机磷菌株的来源。为有机磷的降解机制提供了依据。并且本专利技术的菌株可以从植酸钙中活化出的速效磷含量为5.30mg/L，对植酸钙的活化率达到62.14％，降解有机磷的效果很好。附图说明图1巨大芽孢杆菌FD3-13在有机磷培养基上形成的溶磷圈。具体实施方式本专利技术提供了一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13，所述巨大芽孢杆菌的拉丁文为Bacillusmegaterium，16SrDNA的序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术中，所述三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13，采自河南省洛阳市河南科技大学开元校区试验农场的三年生油用牡丹根际土壤中。在本专利技术中，所述三年生油用牡丹根际土壤的采集方法为：先将土壤表层可见的杂物去除，根据五点采样法，在距离植株8～12cm处利用土钻收集根际土壤，装入无菌袋中，置于冰盒内保存。到达实验室后用毛刷将附着在根系上的土壤刷下来，收集后混匀，放于4℃冰箱中冷藏保存、备用。在本专利技术中，所述三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13的分离步骤包括如下步骤：(1)称取采集得到的三年生油用牡丹根际土壤，放入无菌离心管中，用无菌水定容后，混匀，得到混合均匀的根际土壤溶液；(2)将混合均匀的根际土壤溶液依次进行梯度稀释，得到稀释的根际土壤溶液；(3)将稀释的根际土壤溶液均匀涂布于有机磷固体培养基上，培养并纯化，得到三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13。在本专利技术中，所述三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13的分离步骤在超净工作台中进行的。在本专利技术中，所述无菌离心管中放入的三年生油用牡丹根际土壤的质量为4～6g，优选为5g。在本专利技术中，所述无菌水定容的体积为40～60mL，优选为50mL。在本专利技术中，所述混匀为振荡器混匀。在本专利技术中，所述混匀的时间为15～25min，优选为20min。在本专利技术中，所述根际土壤溶液依次进行梯度稀释的梯度为10倍梯度。在本专利技术中，所述涂布的稀释根际土壤溶液的稀释度为10-6-10-4。在本专利技术中，所述涂布的稀释根际土壤溶液的体积为100μl。在本专利技术中，所述有机磷固体培养基为改良的国际植物研究所磷酸盐生长培养基NBRIP。在本专利技术中，所述NBRIP培养基中的磷酸三钙替换为植酸钙。在本专利技术中，所述植酸钙的用量为2g/L。在本专利技术中，所述培养温度为26～30℃，优选为28℃。在本专利技术中，所述培养为倒置培养。在本专利技术中，所述纯化方式为Z字形划线纯化。在本专利技术中，所述纯化得到的菌株保存在2～6℃的冰箱中，优选为4℃。在本专利技术中，所述纯化步骤在超净工作台中进行。在本专利技术中，所述三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13的鉴定包括如下步骤：(1)提取已纯化菌株的基因组DNA，得到基因组DNA；(2)将基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；(3)将PCR产物进行纯化，得到纯化的PCR产物；(4)通过对纯化的PCR产物进行测序，分析鉴定得到三年生油用牡丹根际的菌株FD3-13为巨大芽孢杆菌。在本专利技术中，所述提取纯化菌株基因组DNA的方式为：利用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒进行提取。在本专利技术中，所述PCR扩增的引物为：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’在本专利技术中，所述将PCR产物进行纯化是采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行纯化。在本专利技术中，所述对纯化的PCR产物进行测序，是在上海派森诺生物科技股份有限公司的ABI3730-XL测序仪上进行双向测序。在本专利技术中，所述对菌株的分析鉴定步骤为：用ChromasPro软件截去无效序列，利用BioEdit软件对双端有效序列进行拼接，然后将有效序列在NCBI数据库中利用Blast程序，与NCBI数据库中的参考序列进行比对，获得与待测菌株序列相似性最大的菌株信息，即为鉴定结果。本专利技术还提供了三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌在解有机磷方面的应用。作为优选，所述有机磷为植酸钙。在本专利技术中，所述菌株解磷能力的定性检测方法为溶磷圈测定法。在本专利技术中，所述溶磷圈测定法为：将纯化得到菌株点接于有机磷固体培养基中，培养，测量溶磷圈和菌落的大小并计算两者的比值。本专利技术还提供了一种解有机磷的方法，包括如下步骤：(1)将巨大芽孢杆菌FD3-13进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷的菌株；(2)将步骤(1)得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌的拉丁文为Bacillus megaterium，16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一株三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌FD3-13，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌的拉丁文为Bacillusmegaterium，16SrDNA的序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的三年生油用牡丹根际巨大芽孢杆菌在解有机磷方面的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述有机磷为植酸钙。


4.一种解有机磷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将巨大芽孢杆菌FD3-13进行扩大培养，得到扩大培养的解有机磷的菌株；
(2)将步骤(1)得到的扩大培养的解有机磷的菌株进行处理，制成解有机磷的菌液；
(3)将解有机磷的菌液接种于有机磷液体培...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兆沛，黄文文，程亚南，王菲，张影，申长卫，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41