一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌制造技术

本发明专利技术公开了一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌。本发明专利技术提供的利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌具体为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ‑G304，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.20414。本发明专利技术对于从乙酸到酰基CoA为原料生产大宗化学品，利用葡萄糖作为还原力的供给，用于工业生产乙醇酸具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌
本专利技术涉及生物
，特别涉及一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌。
技术介绍
乙醇酸(glycolate,glycolicacid)又称为羟基乙酸(hydroxyaceticacid)、甘醇酸，分子式为C2H4O3，含有一个羟基和一个羧基，兼有醇和酸的双重性质。在化学清洗，生物降解，日用化工，纺织工业等行业得到了普遍的应用。尽管化学法是合成乙醇酸的常用方法，但化学法对环境的污染严重，过程中使用氰化物等危险品降低了生产过程的安全性。目前发展的生物法(微生物酶催化法和全生物合成法)合成乙醇酸，其生产过程安全，且对环境友好，是大宗化学品发展的趋势。He等成功地从土壤中分离出一种新产腈水解酶的产碱杆菌(Alcaligenes.sp.ECU0401)。经过优化培养条件和反应条件后，乙醇腈可以通过生长细胞、静置细胞和固定化细胞有效地水解为乙醇酸，经过29次循环转化，乙醇酸的产量为1042g/gCDW(Heetal.,2018,AppliedBiochemBiotech136(5):1428-1440)。一种土壤分离红酵母菌3Pr-126，在优化pH、溶氧等条件后，能产生乙醇酸105g/L。以上这两种使用的是微生物酶催化法，都需要额外添加乙醇腈或丙二醇，相对成本较高，不能满足工业生产的需求。全生物合成法，利用的是乙醛酸循环途径，通过乙醛酸途径产生的乙醛酸，在乙醛酸还原酶的作用下生成乙醇酸。以乙醇和木糖为底物，利用乙醛酸途径，改造后的酵母菌株分批发酵75h能产6.7g/L乙醇酸(Koivistoinenetal.,2013,MicrobialCellFactories,12,82)，最大生产速率为0.1g/gCDW/h；以五碳糖(木糖、L-阿拉伯糖)为底物，利用乙醛酸途径，改造后的菌株GA-10，分批发酵产40g/L，木糖产乙醇酸转化率为0.63g/g(BrianPereiraetal.,2015,MetabolicEngineering,34(6):80-87)；以葡萄糖为底物，利用乙醛酸途径，改造后的大肠杆菌，5L分批发酵，产65.5g/L乙醇酸，糖酸转化率为0.79g/g(Dengetal.,2018,MetabolicEngineering,46,28-34)。中国科学院天津工业生物技术研究所张学礼团队构建得到利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌NZ-Gly303，将该菌株进行5L发酵，发酵70h，乙醇酸产量达到73.3g/L，生产速率达到1.04g/L/h，乙酸到乙醛酸的转化率为1.08g/g，葡萄糖到乙醛酸的转化率为2.58g/g(参见“YongYu,etal.Constructionofacarbon-conservingpathwayforglycolateproductionbysynergeticutilizationofacetateandglucoseinEscherichiacoli.MetabolicEngineering61(2020)152–159”)。如果要更好的应用于工业生产，其糖酸转化率和产量都需要进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌及其应用。第一方面，本专利技术要求保护一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌。本专利技术要求保护的利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌，具体为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.20414。该菌株是从重组大肠杆菌NZ-Gly303出发，通过进化代谢得到的。第二方面，本专利技术要求保护一种菌剂。本专利技术所要求保护的菌剂的其活性成分为前文所述的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304。所述菌剂中除了活性成分还可含有本领域常用的辅料或载体。第三方面，本专利技术要求保护前文所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304或前文所述的菌剂在生产乙醇酸中的应用。第四方面，本专利技术要求保护一种生产乙醇酸的方法。本专利技术所要求保护的生产乙醇酸的方法，可包括如下步骤：对前文所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304进行发酵培养，从而获得乙醇酸。在第三和第四方面中，所述生产乙醇酸为利用葡萄糖和乙酸作为双碳源生产乙醇酸。进一步地，在所述生产乙醇酸的过程中，乙酸在发酵培养基中可以以乙酸盐(如乙酸钠)的形式存在。更进一步地，进行所述发酵培养时使用的发酵培养基可为含20-30g/L(如28g/L)葡萄糖和3-6g/L(如5.2g/L)乙酸钠的无机盐培养基AM1。在本专利技术的具体实施方式中，所述发酵培养基的配方如下：每1L中含有葡萄糖28g/L、5.2g/L乙酸钠、2g/L酵母提取物、NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-KCl0.15g/L、35mMNaHCO3、FeCl3·6H2O2.4μg/L、CoCl2·6H2O0.3μg/L、CuCl2·2H2O0.15μg/L、ZnCl20.3μg/L、Na2MoO4·2H2O0.3μg/L、MnCl2·4H2O0.5μg/L、H3BO30.072μg/L。在进行所述发酵培养时，使用615g/L乙酸钠做补料，乙酸为中和剂。发酵条件为起始OD550nm为0.1，37℃，空气流速3min/L，溶氧25％，转速200-500rpm。实验证明，重组大肠杆菌NZ-Gly303进行5L发酵，发酵70h，乙醇酸产量达到73.3g/L，生产速率达到1.04g/L/h，乙酸到乙醛酸的转化率为1.08g/g，葡萄糖到乙醛酸的转化率为2.58g/g。而重组大肠杆菌NZ-G304进行5L发酵，发酵60h，乙醇酸产量达到84g/L，生产速率达到1.06g/L/h，乙酸到乙醇酸的转化率为1.06g/g，葡萄糖到乙醇酸的转化率为3.05g/g。可见从重组大肠杆菌NZ-Gly303出发，通过进化代谢得到的重组大肠杆菌NZ-G304，其产乙醇酸的能力大幅度提高，同时发酵时长也有所缩短。本专利技术对于从乙酸到酰基CoA为原料生产大宗化学品，利用葡萄糖作为还原力的供给，用于工业生产乙醇酸具有重要意义。保藏说明菌株名称：大肠埃希氏菌拉丁名：Escherichiacoli参椐的生物材料(株)：NZ-G304保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2020年7月22日保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.20414附图说明图1为通过进化代谢获得重组大肠杆菌NZ-G304。在含有30-80g/L乙醇酸(钠)的培养基中代谢进化，提高菌株对乙醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NZ-G304，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.20414。/n

【技术特征摘要】
1.大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.20414。


2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304。


3.权利要求1所述的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304或权利要求2所述的菌剂在生产乙醇酸中的应用。


4.一种生产乙醇酸的方法，包括如下步骤：对权利要求1所述的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)NZ-G304进行发酵培养，从而获得乙醇酸。


5.根据权利要求3所述的应用或权利要求4所述的方法，其特征在于：所述生产乙醇酸为利用葡萄糖和乙酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，朱欣娜，徐洪涛，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12