结合犬PD-L1的PD-L1抗体制造技术

本发明专利技术涉及结合犬PD‑L1的PD‑L1抗体。具体地，本公开内容记载了包括具有特定特性的针对犬PD‑L1的犬源化抗体的抗体。本文件涉及结合这些抗体的犬PD‑L1的表位，以及结合这些表位的抗‑犬PD‑L1抗体，以及犬源化抗‑犬PD‑LI抗体在治疗狗的癌症中的用途。

【技术实现步骤摘要】
结合犬PD-L1的PD-L1抗体本申请是申请日为2015年9月29日的中国专利申请201580052709.9“结合犬PD-L1的PD-L1抗体”的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2014年9月30日提交的美国临时申请序列号62/057,541和于2015年6月8日提交的美国临时申请序列号62/172,511的权益，所述申请两者的内容以其整体通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及具有特定特性的抗-犬PD-L1抗体。本专利技术也涉及针对犬PD-L1的犬源化（caninized）抗体，其具有特定序列并对犬PD-L1具有高结合亲和力。本专利技术还涉及结合这些抗体的犬PD-L1的表位，以及结合这些表位的抗-犬PD-L1抗体。本专利技术还涉及本专利技术的抗体在治疗狗(包括癌症治疗)中的用途。
技术介绍
主要在活化的T和B细胞上表达的免疫抑制性受体(程序性细胞死亡受体1，也被称为程序性死亡受体(PD-1))是与CD28和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)相关的免疫球蛋白超家族的一个成员。PD-1和类似家族成员是含有胞外Ig可变型(V-型)结构域(其结合其配体)和胞质尾区(其结合信号传导分子)的I型跨膜糖蛋白。PD-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传导基序：ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)和ITSM(基于免疫受体酪氨酸的转换基序)。PD-1当结合程序性细胞死亡配体1(也被称为程序性死亡配体1(PD-L1))和/或程序性细胞死亡配体2(也被称为程序性死亡配体2(PD-L2))时减弱T-细胞应答。这些配体中的任一种与PD-1的结合负调节抗原受体信号传导。阻断PD-L1与PD-1的结合增强肿瘤特异性的CD8+T-细胞免疫，同时辅助免疫系统对肿瘤细胞的清除。已经报道了鼠PD-1的三维结构、以及小鼠PD-1与人PD-L1的共晶（co-crystal）结构[Zhang等人,Immunity20:337-347(2004);Lin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:3011-3016(2008)]。PD-L1和PD-L2是含有胞外区域中的IgV-和IgC-样结构域以及不具有已知信号传导基序的短细胞质区域的I型跨膜配体。PD-L1和PD-L2两者组成型表达，或者可以在多种细胞类型(包括非造血组织以及各种肿瘤类型)中诱导。PD-L1不仅在B、T、髓样和树突细胞(DC)上表达，而且在周围细胞(诸如微血管内皮细胞和非淋巴器官例如心脏或肺)上表达。相对照而言，PD-L2仅存在于巨噬细胞和DC上。PD-1配体的表达模式提示，PD-1在维持外周耐受中起作用，并且还可以用于调节外周中的自身反应性T-和B-细胞应答。在任何情况下，现在非常清楚的是，PD-1和PD-L1在至少某些人癌症中起关键作用，据推测通过介导免疫逃避。因此，PD-L1已经被显示在许多小鼠和人肿瘤上表达，且在大多数PD-L1阴性的肿瘤细胞系中可被IFN-γ诱导[Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293-12297(2002);Strome等人,CancerRes.,63:6501-6505(2003)]。此外，已经在许多原发性人肿瘤活组织检查中鉴定出PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞上的表达和/或PD-L1在肿瘤细胞上的表达。此类肿瘤组织包括肺、肝、卵巢、子宫颈、皮肤、结肠、神经胶质瘤、膀胱、乳房、肾、食管、胃、口腔鳞状细胞、泌尿道上皮细胞和胰腺的癌症以及头和颈的肿瘤[Brown等人,J.Immunol.170:1257-1266(2003);Dong等人,Nat.Med.8:793-800(2002);Wintterle等人,CancerRes.63:7462-7467(2003);Strome等人,CancerRes.,63:6501-6505(2003);Thompson等人,CancerRes.66:3381-5(2006);Thompson等人,Clin.CancerRes.13:1757-1761(2007);Nomi等人,Clin.CancerRes.13:2151-2157.(2007)]。更惊人的是，肿瘤细胞上的PD-配体表达已经与跨多个肿瘤类型的人癌症患者的不良预后相关联[综述于Okazaki和Honjo,Int.Immunol.19:813-824(2007)]。此外，Nomi等人[Clin.CancerRes.13:2151-2157(2007)]证明通过施用PD-1或PD-L1指导的抗体在侵袭性胰腺癌的鼠模型中阻断PD-L1与PD-1的结合的治疗功效。这些抗体有效地促进肿瘤反应性的CD8+T细胞向肿瘤中的渗入，从而导致抗肿瘤效应物(包括IFN-γ、粒酶B和穿孔蛋白)的上调。类似地，使用抗体来阻断PD-L1和PD-1的结合在小鼠鳞状细胞癌模型中显著地抑制肿瘤生长[Tsushima等人,OralOncol.42:268-274(2006)]。在其它研究中，用PD-L1转染鼠肥大细胞瘤系导致当与肿瘤特异性CTL克隆共培养时减少的肿瘤细胞裂解。当加入抗-PD-L1单克隆抗体时，裂解被恢复[Iwai等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293-12297(2002)]。在体内，显示了阻断PD-1/PD-L1相互作用增加继承性T细胞转移疗法在小鼠肿瘤模型中的功效[Strome等人,CancerRes.63:6501-6505(2003)]。关于PD-1和PD-L1在癌症治疗中的作用的进一步证据来自用PD-1敲除的小鼠执行的实验，其中表达PD-L1的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长(从而导致肿瘤生长和相关的动物死亡)，但不在PD-1缺陷型小鼠中生长[IwaiY.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12293-12297(2002)]。更近来，针对人PD-1的人源化鼠单克隆抗体已经在人类的癌症疗法中显示了初步成功[参见例如，US8,354,509B2、US8,008,449B2和US7,595,048B2]。抗-PD-L1抗体还可用于慢性病毒感染中。在急性病毒感染后产生的记忆CD8+T细胞是高度功能性的，并且构成保护性免疫的一个重要组分。相对照而言，慢性感染经常特征在于病毒特异性的T-细胞应答的不同程度的功能损害(耗尽)，并且该缺陷是宿主不能消除持久病原体的主要原因。尽管功能性效应T细胞最初在感染的早期阶段产生，但它们在慢性感染的进程期间逐渐丧失功能。Barber等人[Nature439:682-687(2006)]显示，用LCMV的实验室毒株感染的小鼠发展慢性感染，导致血液和其它组织中的高病毒水平。这些小鼠最初发展了稳健的T细胞应答，但最终在T细胞耗尽时屈服于感染。Barber等人发现，通过注射阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用的抗体，可以逆转慢性感染的小鼠中效应T细胞的数目和功能的下降。犬抗体(也称为免疫球蛋白G或IgG)是约150Kd的大四聚体蛋白。每个IgG蛋白由两条相同的、各约25Kd的轻链和两条相同的、各约本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性结合犬程序性死亡配体1(犬PD-L1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含一组六个互补决定区(CDR)，其中三个是轻链CDR：CDR轻1(CDRL1)、CDR轻2(CDRL2)和CDR轻3(CDRL3)；并且其中三个是重链CDR：CDR重1(CDRH1)、CDR重2(CDRH2)和CDR重3(CDRH3)：/n其中CDRH1由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成；/n其中CDRH2由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成；/n其中CDRH3由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成；/n其中CDRL1由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成；/n其中CDRL2由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成；并且/n其中CDRL3由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。/n

【技术特征摘要】
20140930 US 62/057541;20150608 US 62/1725111.特异性结合犬程序性死亡配体1(犬PD-L1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含一组六个互补决定区(CDR)，其中三个是轻链CDR：CDR轻1(CDRL1)、CDR轻2(CDRL2)和CDR轻3(CDRL3)；并且其中三个是重链CDR：CDR重1(CDRH1)、CDR重2(CDRH2)和CDR重3(CDRH3)：
其中CDRH1由SEQIDNO:19的氨基酸序列组成；
其中CDRH2由SEQIDNO:20的氨基酸序列组成；
其中CDRH3由SEQIDNO:21的氨基酸序列组成；
其中CDRL1由SEQIDNO:22的氨基酸序列组成；
其中CDRL2由SEQIDNO:23的氨基酸序列组成；并且
其中CDRL3由SEQIDNO:24的氨基酸序列组成。


2.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体是犬源化抗体。


3.权利要求2的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬可结晶段区(cFc区)，所述cFc区通过在SEQIDNO:66或SEQIDNO:68的氨基酸序列中引入以下取代之一而获得：(i)D31A;(ii)N63A;(iii)D31A和N63A;(iv)P4A；或(v)D31A、N63A、P4A、A93G和P95A。


4.权利要求2的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬可结晶段区(cFc区)，所述cFc区由选自SEQIDNO:62和SEQIDNO:64的氨基酸序列组成。


5.权利要求4的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含铰链区，所述铰链区由选自SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的氨基酸序列组成。

【专利技术属性】
技术研发人员：M莫塞伊，张远征，D巴特斯莫罗佐夫，J埃斯金，I塔佩伊，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL