一种CD44V6纳米抗体及其作为白血病研究试剂的应用制造技术

本发明专利技术具体涉及一种CD44V6纳米抗体及其作为白血病研究试剂的应用。本发明专利技术研究提供了一种羊驼源的CD44V6单克隆抗体，包括靶点抗原羊驼免疫、纳米抗体快速筛选技术、纳米抗体大规模表达纯化。经验证，上述方案制备得到的CD44V6具有良好的诱导白血病细胞分化成熟的效果，可作为一种白血病研究试剂加以应用。

【技术实现步骤摘要】
一种CD44V6纳米抗体及其作为白血病研究试剂的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种CD44V6的纳米抗体，所述纳米抗体的抗原蛋白及上述蛋白作为白血病研究试剂的应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。近20年来重组抗体技术得到迅速的发展，抗体通过与其特定的抗原相结合，一方面用于建立检测抗原的酶联免疫试剂盒，另一方面可以直接结合靶抗原或者携带治疗药物实现在目的细胞上的特异性富集，或通过信号传导通路抑制其与天然配体的结合来影响细胞的生命活动。然而，尽管抗体药物应用范围如此之广，却也存在很多问题，比如研发周期长，生产成本高；难以大规模生产；易降解，储存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂等等，使其在临床上的应用受到一定限制。后来人们逐渐发现在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(Variabledomainofheavychainofheavychainantibody，VHH)和两个常规的CH2与CH3区。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，此也被称作纳米抗体(Nanobody,Nb)。VHH可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核表达和各种真核表达系统，广泛用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。纳米抗体具有独特的性质如分子量小、水溶性好、稳定性强、抗原识别能力强、易于生产等。因此，在体外诊断、肿瘤的诊断与治疗方面比其他抗体更具优势。如今，国外一些公司(如比利时的ablynx公司)和研究机构(如比利时的Muyldermans研究组)针对一系列靶点(IL6R、TNF、IL17、CXCR4、HER2)和适应症(类风湿关节炎、银屑病、乳腺癌)对纳米抗体进行了深入的研究及广泛开发，一些产品分别进入临床前和临床开发阶段。目前国内针对纳米抗体的研究较少，且均处于前期研究阶段尚无产品上市。急性骨髓性白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)是一种骨髓性干细胞异常增殖的血癌，由于干细胞受损，使得白血病细胞增殖、分化、成熟的能力下降，而停滞在细胞发育的不同阶段。未成熟细胞在体内无控制性增殖并积累，取代了正常骨髓，导致正常细胞数量减少，骨髓功能丧失。CD44为分子量80-90KD糖蛋白，含有20个外显子，其中由外显子6-15编码的V1-V10为可变体区，在一些特殊细胞种类中表达。CD44在急慢性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等许多血液系统恶性肿瘤均有表达，且急性髓系白血病(AML)各亚型均表达CD44V6突变体分子。近年来有实验发现特异性抗CD44V6单克隆抗体或其配体透明质酸可逆转AML1至AML5型细胞的分化阻滞，触发白血病细胞的终末分化，提示CD44V6有可能成为AML诱导分化治疗的新靶点，其对应的抗体不仅用于细胞表面抗原和可溶性抗原的检测，也可以用于靶向抗原封闭或诱导白血病分化的启动靶点。
技术实现思路
针对上述研究背景，本专利技术目的在于提供一种CD44V6的纳米抗体，基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。为了实现上述技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一方面，提供一种CD44V6的纳米抗体，所述纳米抗体的抗原结合片段如SEQIDNO:1所示，或其抗原结合片段包含SEQIDNO:1所示序列。针对CD44V6纳米抗体的开发，本专利技术首先针对抗原蛋白序列进行了筛选，采用上述抗原蛋白进行动物免疫能够获得稳定表达的纳米抗体。另外，本专利技术还提供了基于基因工程的CD44V6抗原蛋白制备方法，通过构建重组菌株发酵培养，对发酵物进行分离纯化；其中，由于CD44V6含有二硫键和糖基化位点，因此选择可进行二硫键配对及具有糖基化修饰能力的毕赤酵母表达系统制备抗原。本专利技术第二方面，提供编码所述CD44V6纳米抗体或SEQIDNO:1所示抗原结合片段的核酸分子。本专利技术第三方面，提供第一方面所述CD44V6纳米抗体的制备方法，所述制备方法包括动物免疫后获取抗体血清，通过反转录方式获取抗体序列并构建表达菌株。上述动物免疫优选羊驼进行动物免疫，该纳米抗体没有传统的Fc段，CDR3区比传统抗体更长，其CDR区的5个氨基酸变为亲水性氨基酸。通过重组抗原蛋白免疫羊驼，获取免疫羊驼后的抗体血清，设计兼并引物，反转录PCR，得到总cDNA序列，转入到噬菌体展示文库中，通过亲和力和胰高血糖素拮抗性验证，得到候选抗体序列。最后通过筛选稳定表达的菌株实现所述纳米抗体的大量制备。由于所述纳米抗体及抗原蛋白与CD44具有良好的亲和性，有望作为一种靶向诱导剂诱导药物集中于白血病细胞表面。基于该特性，本专利技术第四方面，还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述CD44V6的纳米抗体和/或NO:1所示的多肽。第五方面，提供一种药物，所述药物具有靶向基团修饰述靶向基团包括第五方面所述药物组合物。第六方面，提供一种白血病模型研究试剂，所述研究试剂中包括第五方面所述药物组合物。以上一个或多个技术方案的有益效果是：本专利技术提供了一种CD44V6的纳米抗体，相比传统的单克隆抗体具有更小的分子量和稳定性，作为生物制剂应用于人体有望具有更好的生物利用度。所述纳米抗体具有良好的白血病细胞诱导分化作用，有望作为一种分化诱导剂参与白血病模型相关研究。另外，本专利技术还开发了所述CD44V6的纳米抗体的制备方法，可实现高纯度抗体的大量制备。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为实施例3中所述纳米抗体扩增片段电泳图；图2为所述CD44V6的测序结果；图3为所述CD44V6中CDR3区的测序结果；图4为实施例4中所述竞争法Elisa检测抗原抗体反应；图5为实施例5中所述PAGE电泳检测抗体纯度与分子大小结果图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CD44V6的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的抗原结合片段如SEQ ID NO:1所示，或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示序列。/n

【技术特征摘要】
1.CD44V6的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的抗原结合片段如SEQIDNO:1所示，或其抗原结合片段包含SEQIDNO:1所示序列。


2.如权利要求1所述CD44V6的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包括其修饰后的物质，所述修饰包括但不限于聚乙二醇、抗生物素蛋白、链霉亲和素、各种分子，例如生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂以及用它们修饰的第二抗体。


3.如权利要求2所述CD44V6的纳米抗体，其特征在于，所述放射性同位素的例子包括18F，15O，13N，11C，82Rb，68Ga，198Au，199Au，32P，33P，125I，131I，123I，90Y，186Re，188Re，62Cu，64Cu，67Cu，47Sc，103Pb，109Pb，212Pb，71Ge，77As，105Rh，113Ag，119Sb，131Cs，143Pr，161Tb，177Lu，191Os，193Pt，197Hg；
或，所述螯合剂，包括DTPA、DOTA、DFO；
或，所述荧光剂包括FITC、罗丹明，藻红蛋白、藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，OPA和氟胺；
或，所述酶的实例包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和碱性磷酸酶；
或，所述细胞毒性物质的实例包括白喉A链、铜绿假单胞菌外毒素A，百日咳毒素、蓖麻毒蛋白A链、modesin毒素，α-sarcin，diandian，curcin，crotin，gelonin或mitogellin。其实例包括克林霉素、苯霉素、线虫霉素、单端孢菌素、天花粉蛋白、细胞松弛素B、二羟基蒽indione、米托蒽醌、依米丁、秋水仙碱和皂草素；
或，所述抗肿瘤剂，并且其实例包括烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、抗肿瘤植物成分、BRM、血管生成抑制剂、细胞粘附抑制剂，基质金属蛋白酶抑制剂。...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜国胜，王希娣，张丹凤，高伟，陈梅英，
申请(专利权)人：姜国胜，
类型：发明
国别省市：山东;37