一种结合血清白蛋白的蛋白及其用途制造技术

本申请属于生物医药技术领域，更具体地，本申请涉及一种结合血清白蛋白的人源化单域抗体以及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物。本申请的人源化单域抗体能够高效结合人血清白蛋白，从而延长与其连接的分子的体内半衰期。本申请的人源化单域抗体及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物可用于制备预防和/或治疗或辅助治疗肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病或发育相关的疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种结合血清白蛋白的蛋白及其用途
本申请属于生物医药
，更具体地，本申请涉及一种结合血清白蛋白的单域抗体以及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物，所述单域抗体能够延长与其连接的活性剂的体内半衰期。技术背景大部分蛋白类药物为了达到治疗效果，往往需要多次、高剂量注射，增加了治疗负担，同时降低了患者依从性。因此目前开发了多种蛋白长效化方式，包括对蛋白进行突变修饰，提高蛋白稳定性，避免被蛋白酶识别分解，但突变后易产生免疫原性，降低药物的体内功能；另一种是进行PEG偶联，通过增加蛋白的水合半径，避免被肾脏快速清除，同时可遮蔽部分蛋白酶位点，延缓降解速率，但高分子量的PEG易导致蛋白活性损失，且存在肾脏积累导致肾小球空心化的风险。本领域迫切需要更优的蛋白长效化技术，并应用于临床药物开发，满足用药需求，提高患者依从性。
技术实现思路
为解决目前长效化蛋白的难题，特异性结合人血清白蛋白的驼源抗体引起了研究者的关注，该抗体可通过结合人血清白蛋白而实现延长半衰期的作用，且因其分子量小，可避免HSA、Fc等融合蛋白对活性、工艺及药效的不利影响。然而，驼源抗体进入人体后有较强的免疫原性，易产生抗药抗体。因此，为了降低抗药抗体的产生，提高药物的安全性，需对驼源抗体进行人源化改造。然而，由于供体抗体(例如驼源抗体)的CDR与受体抗体(例如人源抗体)的FR之间的匹配问题，人源化抗体的预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)通常低于非人源供体抗体(例如驼源抗体)。对此，尽管本领域的研究人员已对抗体的人源化已取得了一些进展，但是，如何对某一供体抗体进行充分的人源化，以使得所产生的人源化抗体既具有尽可能高的人源化程度，又能够尽可能地保留供体抗体的预期性质，现有技术并没有提供指导。技术人员需要针对具体供体抗体进行摸索、探究和改造，付出大量的创造性劳动才有可能获得，既具有高人源化程度、又保留具体供体抗体的预期性质的人源化抗体。在本申请中，专利技术人付出了大量的创造性劳动，对驼源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发人源化单域抗体。本申请的人源化的单域抗体抗体是极为有利的，其不仅保留了(或甚至提高了)亲本驼源单域抗体的功能和性质，例如以很高的亲和力和特异性结合人血清白蛋白，并且具有用于延长与其连接的活性剂的体内半衰期的潜力，而且具有极高的人源化程度，可安全地施用给人受试者，而不引发或较少引发免疫原性反应。此外，本申请的人源化的单域抗体抗体具有以较低成本在微生物表达系统中生产的可能，具有作为长期大剂量需要的慢性疾病治疗药物的的巨大潜力。所以，本申请的抗体具有重大的临床价值。单域抗体本申请第一方面，提供了一种人源化的单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体基本由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4。在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述FRs包含：序列为SEQIDNO:10或17，或与SEQIDNO:10或17相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQIDNO:11或18，或与SEQIDNO:11或18相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQIDNO:12或19，或与SEQIDNO:12或19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；和序列为SEQIDNO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；并且，所述FR1-FR4还包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述FRs包含：序列为SEQIDNO:10或17，或与SEQIDNO:10或17相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQIDNO:11或18，或与SEQIDNO:11或18相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQIDNO:12或19，或与SEQIDNO:12或19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；和序列为SEQIDNO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；并且，所述FR1-FR4还包含：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，上述FRs进一步包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L或S、在位点96上的A或P、在位点105上的A或T、在位点106上的E或I。在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，上述FRs进一步包含：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义所述FRs包含：序列为SEQIDNO:14或20，或与SEQIDNO:14或20其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQIDNO:15或21，或与SEQIDNO:15或21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQIDNO:16或22，或与SEQIDNO:16或22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；和序列为SEQIDNO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；并且，所述FR1-FR4还包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义所述FRs包含：序列为SEQIDNO:14或20,或与SEQIDNO:14或20其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQIDNO:15或21,或与SEQIDNO:15或21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性结合血清白蛋白的单域抗体或其抗原结合片段，其中，/n(1)根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：/n下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：37的CDR3；以及，/n下述4个构架区(FRs)：序列为SEQ ID NO:10或17，或与SEQ ID NO:10或17相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:11或18，或与SEQ ID NO:11或18相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:12或19，或与SEQ ID NO:12或19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；/n并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；/n或者，/n(2)根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：/n下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，/n下述4个构架区(FRs)：序列为SEQ ID NO:14或20，或与SEQ ID NO:14或20相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:15或21，或与SEQ ID NO:15或21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:16或22，或与SEQ ID NO:16或22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；/n并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；/n优选地，(1)-(2)任一项中所述的置换为保守置换。/n...

【技术特征摘要】
20191112 CN 20191109973911.特异性结合血清白蛋白的单域抗体或其抗原结合片段，其中，
(1)根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQIDNO：4的CDR1，序列为SEQIDNO：5的CDR2，序列为SEQIDNO：6或SEQIDNO：37的CDR3；以及，
下述4个构架区(FRs)：序列为SEQIDNO:10或17，或与SEQIDNO:10或17相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQIDNO:11或18，或与SEQIDNO:11或18相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQIDNO:12或19，或与SEQIDNO:12或19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；序列为SEQIDNO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；
或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQIDNO：7的CDR1，序列为SEQIDNO：8的CDR2，序列为SEQIDNO：9的CDR3；以及，
下述4个构架区(FRs)：序列为SEQIDNO:14或20，或与SEQIDNO:14或20相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQIDNO:15或21，或与SEQIDNO:15或21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQIDNO:16或22，或与SEQIDNO:16或22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；序列为SEQIDNO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，(1)-(2)任一项中所述的置换为保守置换。


2.权利要求1所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L或S、在位点96上的A或P、在位点105上的A或T、在位点106上的E或I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点49上的L或S、在位点84上的A或P、在位点93上的A或T、在位点94上的E或I；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。


3.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E或Q；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E。


4.权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的S、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的S、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I、在位点108上的L。


5.权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的S、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的S、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I、在位点108上的L。


6.权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的A、在位点105上的A、在位点106上的E、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的A、在位点93上的A、在位点94上的E、在位点108上的L。


7.权利要求1-6任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中：
根据IMGT编号系统定义，FR1的序列选自SEQIDNO:10或17，FR2的序列选自SEQIDNO:11或18，FR3的序列选自SEQIDNO:12或19，FR4的序列选自SEQIDNO:13；
优选地，FR1序列为SEQIDNO:10，FR2序列为SEQIDNO:11，FR3序列为SEQIDNO:12，FR4为SEQIDNO:13；
或者，
根据Kabat编号系统定义，FR1的序列选自SEQIDNO:14或20，FR2的序列选自SEQIDNO:15或21，FR3的序列选自SEQIDNO:16或22，FR4的序列选自SEQIDNO:13；
优选地，FR1序列为SEQIDNO:14，FR2序列为SEQIDNO:15，FR3序列为SEQIDNO:16，FR4为SEQIDNO:13。


8.权利要求1-7任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)根据IMGT编号系统定义，序列为SEQIDNO：4的CDR1，序列为SEQIDNO：5的CDR2，序列为SEQIDNO：6的CDR3；以及，序列为SEQIDNO:10的FR1，序列为SEQIDNO:11的FR2，序列为SEQIDNO:12的FR3，序列为SEQIDNO:13的FR4；或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，序列为SEQIDNO：7的CDR1，序列为SEQIDNO：8的CDR2，序列为SEQIDNO：9的CDR3；以及，序列为SEQIDNO:14的FR1，序列为SEQIDNO:15的FR2，序列为SEQIDNO:16的FR3，序列为SEQIDNO:13的FR4。


9.权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQIDNO：3所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQIDNO：3相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQIDNO：3相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述变体序列保留了特异性结合人血清白蛋白的活性；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I；
优选地，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的E；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:3所示的序列。


10.权利要求1-7任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)根据IMGT编号系统定义，序列为SEQIDNO：4的CDR1，序列为SEQIDNO：5的CDR2，序列为SEQIDNO：37的CDR3；以及，序列为SEQIDNO：17的FR1，序列为SEQIDNO：18的FR2，序列为SEQIDNO：19的FR3，序列为SEQIDNO：13的FR4；或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，序列为SEQIDNO：7的CDR1，序列为SEQIDNO：8的CDR2，序列为SEQIDNO：9的CDR3；以及，序列为SEQIDNO：20的FR1，序列为SEQIDNO：21的FR2，序列为SEQIDNO：22的FR3，序列为SEQIDNO：13的FR4。


11.权利要求1-7和10中任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQIDNO：1所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQIDNO：1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQIDNO：1相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述变体序列保留了特异性结合人血清白蛋白的活性；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体还包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L、在位点96上的A、在位点105上的A、在位点106上的E；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的L、在位点84上的A、在位点93上的A、在位点94上的E；
优选地，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的Q；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:1所示的序列。


12.权利要求1-7任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)根据IMGT编号系统定义，序列为SEQIDNO：4的CDR1，序列为SEQIDNO：5的CDR2，序列为SEQIDNO：6的CDR3；以及，序列为SEQIDNO：17的FR1，序列为SEQIDNO：11的FR2，序列为SEQIDNO：12的FR3，序列为SEQIDNO：13的FR4；或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，序列为SEQIDNO：7的CDR1，序列为SEQIDNO：8的CDR2，序列为SEQIDNO：9的CDR3；以及，序列为SEQIDNO：20的FR1，序列为SEQIDNO：15的FR2，序列为SEQIDNO：16的FR3，序列为SEQIDNO：13的FR4。


13.权利要求1-7和12中任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQIDNO：2所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQIDNO：2相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQIDNO：2相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述变体序列保留了特异性结合人血清白蛋白的活性；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，所述变体还包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I；
优选地，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的Q；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:2所示的序列。


14.权利要求1-13任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段是人源化的VHH；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段的V基因所编码的区段的人源化程度不低于79％(例如80％、85％、89％、90％、93％、95％、97％、或100％)；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段的J基因所编码的区段的人源化程度不低于89％(例如90％、93％、95％、97％、98％、或100％)。


15.权利要求1-14任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；
优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。


16.多特异性抗体，其包含权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及，另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；
优选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体；
可选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与肿瘤特异性抗原(TSA)，肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen,TAA)，T细胞衔接器(Tcellengager)分子，肿瘤免疫相关分子或自身免疫调节相关分子中至少一个分子或抗原的结合特异性；
优选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与PD-1、PD-L1、CD19、CD20、CTLA4、IL6、IL6R或TNFα中至少一个的抗原结合特异性。


17.权利要求16所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体从其N端至C端具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有结合同一抗原或不同抗原的活性；
或者，所述多特异性抗体从其N端至C端具有选自下列的结构：B1-L1-A-L2-B2，A-L1-B1-L2-B2，B1-L1-B2-L2-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述B1和B2具有结合同一抗原或不同抗原的活性；
可选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体，并且L、L1和L2各自独立地为(G4S)n，其中n选自0-10的整数，L、L1和L2彼此相同或不同；优选地，L、L1和L2各自独立地选自SEQIDNO:33或34所示的序列。


18.融合蛋白，其包含权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；
优选地，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白；
优选地，所述另外的生物活性多肽直接或通过接头连接至所述单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端；
优选地，所述融合蛋白从其N端至C端具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的生物活性多肽；
或者，所述融合蛋白从其N端至C端具有选自下列的结构：B1-L1-A-L2-B2，A-L1-B1-L2-B2，B1-L1-B2-L2-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的生物活性多肽；
可选地，L、L1和L2各自独立地为(G4S)n，其中n选自0-10的整数，L、L1和L2彼此相同或不同；优选地，L、L1和L2各自独立地选自SEQIDNO:33或34所示的序列。


19.权利要求18所述的融合蛋白，其包含一个或多个(例如，两个)所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个或多个(例如，两个)所述另外的生物活性多肽；其中，所述多个单域抗体或其抗原结合片段是相同或不同的，所述多个另外的生物活性多肽是相同或不同的；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及两个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽各自直接或通过linker分别连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽直接或通过linker彼此连接，所述彼此连接的两个另外的生物活性多肽进一步直接或通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端或C端；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽各自直接或通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和C端，或C端和N端。


20.权利要求18或19所述的融合蛋白，其中，所述生物活性多肽选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、G蛋白偶联受体、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白、人生长激素(GH)、细胞因子结合蛋白、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤抑制子、转移生长因子、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、热休克蛋白家族成员(如热休克蛋白70或GP96),或其任意组合；
优选地，所述生物活性多肽选自G-CSF、GH、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白，或其任意组合。


21.权利要求18-20任一项所述的融合蛋白，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段如权利要求8或9中所定义，所述生物活性多肽选自G-CSF、GH、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白，或其任意组合；
优选地，所述生物活性多肽具有选自下列的序列：SEQIDNOs:23、27、29-31任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQIDNOs:23、27、29-31任一项所示的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述变体序列保留了其所源自的序列的生物学功能；
优选地，所述生物活性多肽选自下列的序列：SEQIDNOs:23、27、29-31；
优选地，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQIDNOs:24、25、26、28、32、38任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQIDNOs:24、...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙虎，喻海旻，赵明军，刘登念，肖亮，薛彤彤，王晶翼，
申请(专利权)人：四川科伦博泰生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51