基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法技术

本发明专利技术涉及C反应蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法；首先制备固态纳米孔并活化，将带有羧基末端的硅烷固定在所述固态纳米孔表面，再与末端带氨基的适配体DNA反应，制得复合固态纳米孔，使用所述复合纳米孔检测C反应蛋白的过孔信号，测得其含量；用硅基氮化硅膜作为基底材料，通过分析偏压下C反应蛋白进入纳米孔所产生的阻塞电流与阻塞时间的长短，可以得到蛋白质的体积、表面电荷、构象、浓度等信息；相比于传统的C反应蛋白的检测方法，检测更为快速、灵敏，改善纳米孔不规整的内表面形貌和不均匀的电荷分布带来的测试低频噪音干扰，减小C反应蛋白在纳米孔表面的吸附情况。

【技术实现步骤摘要】
基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法
本专利技术涉及C反应蛋白检测
，具体涉及一种基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法。
技术介绍
C反应蛋白是一种由五个相同的同源亚基非共价结合而成的五聚体结构，呈对称的环状五球体。CRP中每个亚基含有206个氨基酸残基，分子量约为120KDa，亚基与亚基之间通过静电盐桥与两个钙离子相连，从而形成五聚体结构。在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。CRP不仅是一种非特异的炎症标志物，其本身直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。CRP与补体C1q及FcTR的相互作用使其表现出很多生物活性，包括宿主对感染的防御反应、对炎症反应的吞噬作用和调节作用等。与受损细胞、凋亡细胞及核抗原的结合，使其在自身免疫病方面也起着重要作用。在人体出现炎症、组织损伤、感染等症状时会急剧上升，而恢复健康后其浓度又会下降。因此，检测和监控CRP水平，并对其进行定量分析，对于疾病和炎症阶段的分类以及治疗是至关重要的。传统的用于C反应蛋白的检测方法包括：酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫比浊法、免疫扩散法、表面等离子体共振(SPR)，乳胶凝集法、化学发光法等方法。这些技术已被证明可以成功地检测CRP，但存在不同的缺点，它们通常需要较长的反应时间，较为复杂的反应步骤，对操作人员有较高的要求和试剂昂贵等问题。而纳米孔技术得益于免标记、速度快、低成本、单分子检测等优势，为CRP的表征提供了新方向，可以达到传统方法达不到的精度与灵敏度。但是，由于固态纳米孔的表面性质非常复杂，并且CRP表面电荷分布不均匀，与氮化硅纳米孔之间非常容易产生吸附，因此可以通过对纳米孔表面进行改性，降低二者之间的相互作用，减小吸附。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实际要解决的问题是提供一种使用带有羧基末端硅烷和末端带氨基的适配体DNA序列的复合固态纳米孔灵敏检测CRP的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术拟对纳米孔与C反应蛋白进行修饰改性，其一，通过将C反应蛋白与适配体DNA进行结合从而形成复合物，通过直接检测该复合物的浓度即可得到CRP的含量，该法能够有效减弱C反应蛋白减弱与孔壁的相互作用；其二，通过硅烷试剂与适配体DNA的结合从而形成复合孔，可以改善纳米孔表面的化学性质，消除过孔分子与孔壁间的非特异性结合(即吸附)，从而得到一种超灵敏的CRP检测方法。基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法，制备固态纳米孔膜并活化，将带有羧基末端的硅烷固定在所述固态纳米孔表面，再与末端带氨基的适配体DNA反应，制得复合固态纳米孔，使用所述复合纳米孔膜检测C反应蛋白的过孔信号，测得其含量。具体的，所述方法包括如下步骤：1)固态纳米孔膜的活化去除固态纳米孔表面的杂质后用食人鱼洗液进行浸泡，再清洗制得活化后的固态纳米孔；2)末端带羧基的硅烷分子的固定氮气条件下，将步骤1)制得的所述活化后的固态纳米孔与酸性带有羧基末端的硅烷试剂水溶液进行反应制得固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔；3)CRP的适配体DNA的固定将步骤2)制得的所述固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔经EDC/NHS活化后浸泡在含0.1～1μM末端带氨基的适配体DNA、pH5.5的0.1MMES溶液中反应，制得所述复合固态纳米孔；4)使用步骤3)在所述复合固态纳米孔的膜片钳上外加偏压，在电解质溶液中检测C反应蛋白的含量。进一步，在步骤1)前进行固态纳米孔的制备：在硅基氮化硅膜上制出直径为15～28nm的孔道。具体的，所述固态纳米孔的制备采用介电质击穿的方式，使用的电导液为1MKCl、10mMTris、1mMEDTA、pH8。进一步，步骤1)中去除固态纳米孔表面的杂质步骤为：用加热的去离子水浸泡5～10分钟，去除无机杂质；用体积比丙酮：异丙醇：去离子水＝1:1:1的混合溶剂浸泡去除有机杂质。进一步，步骤1)中所述浸泡的温度为60±5℃；时间为0.5～1小时。进一步，步骤2)中所述酸性带有羧基末端的硅烷试剂水溶液由等体积的带有羧基末端的硅烷试剂、有机酸和水介质反应制得。进一步，步骤4)所述电解质溶液为1MKCl、2mMCaCl2、10mMTris、pH7.4。进一步，步骤4)所述偏压强度为200～400mV。本专利技术目的之二在于提供一种带有羧基末端硅烷和末端带氨基的适配体DNA序列的复合固态纳米孔。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：复合固态纳米孔，由如下方法制备而得：1)固态纳米孔的活化去除固态纳米孔表面的杂质后用食人鱼洗液进行浸泡，再清洗制得活化后的固态纳米孔；2)末端带羧基的硅烷分子的固定氮气条件下，将步骤1)制得的所述活化后的固态纳米孔与酸性带有羧基末端的硅烷试剂水溶液进行反应清洗制得固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔；3)CRP的适配体DNA的固定将步骤2)制得的所述固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔经EDC/NHS活化后浸泡在含0.1～1μM末端带氨基的适配体DNA、pH5.5的0.1MMES溶液中反应，制得所述复合固态纳米孔。本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术是基于单分子固态纳米孔检测技术，用硅基氮化硅膜作为基底材料，通过分析偏压下C反应蛋白进入纳米孔所产生的阻塞电流与阻塞时间的长短，可以得到蛋白质的体积、表面电荷、构象、浓度等信息。2.本方法相比于传统的C反应蛋白的检测方法，检测更为快速、灵敏。通过硅烷试剂作为链接剂，将适配体结合在纳米孔的孔内，能够很好的改善纳米孔不规整的内表面形貌和不均匀的电荷分布带来的测试低频噪音干扰，减小C反应蛋白在纳米孔表面的吸附情况。3.由于纳米孔内引入了适配体，适配体会与C反应蛋白产生相互作用，从而延长C-反应蛋白的过孔时间，能够显著提高纳米孔对C反应蛋白的捕获率。从而能够实现在较低浓度下，检测到C反应蛋白的过孔信号，为C反应蛋白检测提供了超灵敏的核心检测部件。附图说明所举实施例是为了更好地对本专利技术进行说明，但并不是本专利技术的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。图1：复合固态纳米孔原理示意图；图2：C反应蛋白与适配体DNA的复合物的阻塞时间与阻塞电流幅值图；图3：C反应蛋白通过适配体DNA的复合纳米孔的阻塞时间与阻塞电流幅值图。具体实施方式所举实施例是为了更好地对本专利技术进行说明，但并不是本专利技术的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法，其特征在于，制备固态纳米孔并活化，将带有羧基末端的硅烷固定在所述固态纳米孔表面，再与末端带氨基的适配体DNA反应，制得复合固态纳米孔，使用所述复合纳米孔检测C反应蛋白的过孔信号，测得其含量。/n

【技术特征摘要】
1.基于复合固态纳米孔单分子技术的C反应蛋白检测方法，其特征在于，制备固态纳米孔并活化，将带有羧基末端的硅烷固定在所述固态纳米孔表面，再与末端带氨基的适配体DNA反应，制得复合固态纳米孔，使用所述复合纳米孔检测C反应蛋白的过孔信号，测得其含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)固态纳米孔的活化
去除固态纳米孔表面的杂质后用食人鱼洗液进行浸泡，再清洗制得活化后的固态纳米孔；
2)末端带羧基的硅烷分子的固定
氮气条件下，将步骤1)制得的所述活化后的固态纳米孔与酸性末端带羧基的硅烷试剂水溶液进行反应制得固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔；
3)CRP的适配体DNA的固定
将步骤2)制得的所述固定有羧基硅烷分子的固态纳米孔经EDC/NHS活化后浸泡在含0.1～1μM末端带氨基的适配体DNA、pH5.5的0.1MMES溶液中反应，制得所述复合固态纳米孔；
4)在步骤3)所得所述复合固态纳米孔的膜片钳上外加偏压，在电解质溶液中检测C反应蛋白的含量。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1)前进行固态纳米孔的制备：在硅基氮化硅膜上制...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁丽媛，吴吉，王德强，朱锐，王忠，谢婉谊，殷博华，唐鹏，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：重庆;50