基于溶剂诱导蛋白沉淀探测配体与蛋白相互作用或亲和力的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于溶剂诱导蛋白沉淀探测配体与蛋白相互作用或亲和力的方法，具体涉及一种利用蛋白结合配体后对溶剂诱导变性而导致沉淀具有更高耐受能力的原理而建立的方法。配体组和对照组的蛋白溶液分别加入等量的溶剂使蛋白沉淀，然后利用定量技术对配体组和对照组中保持溶解或沉淀的各个蛋白的浓度进行监测，通过比较配体组和对照组中蛋白沉淀的差异实现高通量筛选配体结合靶标蛋白的目的。该方法具有特异性高、通量高、应用范围广，并能够监测配体与靶标蛋白相互作用亲和力等特点。此外，在某些实施例中，利用溶剂变性方法鉴定的靶标蛋白与基于热变性方法鉴定的具有互补性。

【技术实现步骤摘要】
基于溶剂诱导蛋白沉淀探测配体与蛋白相互作用或亲和力的方法
本专利技术属于蛋白组学研究方向药物靶标蛋白筛选领域，尤其涉及一种基于溶剂诱导蛋白沉淀探测配体与蛋白相互作用或亲和力的方法。
技术介绍
药物靶蛋白的鉴定是药物研发中的重要环节，新靶点的发现可为药物筛选提供突破口，为先导化合物的发现和设计提供重要的理论依据。通过蛋白组学或生物技术等手段对药物的潜在靶点进行鉴定与挖掘，对于研究药物发挥其疗效的分子机制、毒副作用和其它医疗用途具有重要意义。目前，已经开发的一系列基于蛋白组学用于鉴定药物靶蛋白的方法，主要分为两类：小分子修饰/固定模式和非标记药物模式。前者包括基于活性探针分析(ABPP)(VanEsbroeckACM,etal,Science,2017,356:1084-1087)和亲和层析方法(HoehenwarterW,etal,Molecular&CellularProteomics,2013,12:369-380)，该策略中小分子化学修饰的需求成为鉴定药物靶标的主要障碍之一，存在的局限性主要包括：1)药物固定或修饰后改变了药本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于溶剂诱导蛋白沉淀探测配体与蛋白相互作用的方法，其特征在于，该方法利用蛋白结合配体后对溶剂诱导变性而导致沉淀的耐受能力不同而建立；配体组和对照组的蛋白溶液分别加入等量的溶剂使蛋白沉淀，然后利用定量技术对配体组和对照组中保持溶解蛋白或沉淀的各个蛋白的浓度进行监测，通过比较配体组和对照组中蛋白沉淀的差异，筛选出配体结合靶标蛋白。/n

【技术特征摘要】
20191120 CN 20191114096831.一种基于溶剂诱导蛋白沉淀探测配体与蛋白相互作用的方法，其特征在于，该方法利用蛋白结合配体后对溶剂诱导变性而导致沉淀的耐受能力不同而建立；配体组和对照组的蛋白溶液分别加入等量的溶剂使蛋白沉淀，然后利用定量技术对配体组和对照组中保持溶解蛋白或沉淀的各个蛋白的浓度进行监测，通过比较配体组和对照组中蛋白沉淀的差异，筛选出配体结合靶标蛋白。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的步骤为：
(a)于待检蛋白溶液中加入配体，作为配体组；不加入配体的待检蛋白溶液，作为对照组；分别孵育；
(b)在上述两组混合物中分别加入等量溶剂诱导蛋白部分沉淀；
(c)检测蛋白混合物上清液和/或沉淀中各个蛋白的丰度；
(d)比较配体组和对照组中蛋白丰度的差异(即同一蛋白在上清液和/或沉淀中丰度的差异)确定配体靶标蛋白。


3.一种基于溶剂诱导蛋白沉淀检测配体与蛋白之间亲和力的方法,该方法包括：
(a)将一系列浓度(通常选择配体5个不同终浓度点或6个以上不同终浓度点，其中一个浓度点为无配体的对照点,即配体终浓度为0的对照组)的同一种配体与待检蛋白溶液分别进行孵育；
(b)在含有蛋白和配体的混合物中加入一定剂量(优选相同终浓度)的溶剂进行沉淀蛋白；
(c)分别检测含有蛋白和配体混合物的上清液和/或沉淀中各个蛋白的丰度；
(d)以横坐标为不同药物浓度，纵坐标为蛋白丰度拟合曲线并通过计算得到半最大效应浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，EC50)值，获得配体与靶标蛋白之间的结合强度信息(即亲和力)。其中计算方程：Y＝min+(max-min)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))，Y为纵坐标蛋白丰度，X为不同的药物浓度，min和max分别为Y轴对应蛋白丰度的最小值和最大值，HillSlope指的是曲线最大斜率的绝对值(即曲线中点)。


4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，进行步骤C检测之前，采用离心将可溶性蛋白(上清液)与沉淀蛋白进行分离。


5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，蛋白溶液包括一种蛋白或二种以上蛋白混合物；蛋白混合物包括细胞或组织提取液中的一种或两种以上；细胞或组织提取液来源于人、动物、植物或细菌中的一种或两种以上。


6.如权利要求2、3或5所述的方法，其特征在于，蛋白溶液包括血液或血浆中的一种或两种以上；血液或血浆来源于人或动物中的一种或两种。


7.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，蛋白溶液是采用使细胞或组织中的一种或两种以上中的蛋白保持天然构象(蛋白在活细胞或组织中特定的空间结构)的提取条件；
优选，提取条件如：采用磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffersaline，PBS)或加入含有体积百分比0.2-0.4％乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40，NP-40)的PBS作为缓冲液，并结合2-5次的反复的冻融过程提取，冻融过程为液氮冷冻和10-50℃融化。


8.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，配体包括药物，代谢产物，植物提取物或天然产物，食品添加剂，环境污染物，农业杀虫剂或除草剂，环境剂，金属离子，纳米粒子，肽段，蛋白和可能与蛋白相...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶明亮，张晓磊，胡良海，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21