用于检测白蛋白的组合物和方法技术

本公开提供一种用于确定样品中白蛋白的量的方法。在一个实施例中，所述方法涉及用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂处理所述样品；将所述样品与白蛋白的选择性底物组合，所述选择性底物具有羧酸酯键，使得所述羧酸酯键裂解以产生水解产物；检测在一时间段内产生的所述水解产物的量；以及基于所述时间段内所述水解产物的量，确定所述样品中所述白蛋白的量。

【技术实现步骤摘要】
用于检测白蛋白的组合物和方法
本公开大体上涉及医学诊断。更具体地，本公开涉及用于特异性检测和量化白蛋白的组合物和方法。
技术介绍
白蛋白是通常发现于血浆中的非糖基化球状蛋白家族。血清白蛋白是人血浆中的主要蛋白质并且执行多种生理功能，诸如维持胶体渗透压、转运各种生物分子和发挥抗氧化作用。白蛋白测定通常在临床生物化学实验室中进行。举例来说，尿白蛋白已广泛用作具有肾损伤(如糖尿病、高血压和链球菌感染后的急性肾小球肾炎)的患者的重要生物标志物。成人血清中的正常白蛋白范围是34-54g/L，而低白蛋白可能与肝病、肾病综合征、烧伤、蛋白丢失性肠病、吸收不良、营养不良、妊娠晚期、外来物质、基因变异以及恶性肿瘤相关。已开发许多方法来定量测量白蛋白水平，包括电泳、HPLC、免疫化学分析以及染料结合分析。电泳法缓慢、昂贵，需要相对大的样品体积并且容易过高估计血清白蛋白浓度。HPLC法无法定量小于10KDa的白蛋白衍生片段；其它尿蛋白(如转铁蛋白)通常在尺寸排阻HPLC中与白蛋白共洗脱。尽管免疫化学分析对白蛋白估计具有特异性并且有许多变化形式可用，但这些方法一般成本高并且需要较长的培育时间和洗涤步骤。目前，一些染料结合分析(如基于甲基橙和溴甲酚绿的染料结合分析)是可用的。但它们的特异性相对低，因为样品中的其它蛋白质也能够结合这些染料。白蛋白结合并且转运许多疏水化合物，这些疏水化合物包括循环中的脂质。在结合脂质或酯时，白蛋白的某些酪氨酸残基(例如Tyr150和Tyr411)可显示酯酶活性(称作伪酯酶)。许多化合物已显示是白蛋白的底物，如乙酸α-萘酯和乙酸β-萘酯、对硝基苯酚乙酸酯(NPA)、脂肪酸酯、阿司匹林(aspirin)、酮洛芬葡萄糖苷酸(keoprofenglucuronide)、环磷酰胺、烟酸酯、辛酰基饥饿素(octanoylghrelin)、硝基乙酰苯胺、硝基三氟乙酰苯胺以及有机磷化合物(参见：GoncharovNV等人，《分子(Molecules)》(2017)22:1201)。已使用一些作为白蛋白的底物的探针来评定白蛋白浓度(参见：例如，Yang等人的US9340821)。然而，探针的特异性限制了其在生物样品中定量白蛋白的临床应用。因此，存在持续的需求来开发新组合物和方法以精确且高效测量生物样品中的白蛋白水平。
技术实现思路
本公开在一个方面中提供一种用于确定样品中白蛋白的量的方法。在一个实施例中，所述方法涉及用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂、或选择性使非白蛋白酯酶活性失活的酯酶失活剂处理所述样品；将所述样品与白蛋白的选择性底物组合，所述选择性底物具有羧酸酯键，使得所述羧酸酯键裂解以产生水解产物；检测在一时间段内产生的所述水解产物的量；以及基于所述时间段内产生的所述水解产物的量，确定所述样品中所述白蛋白的量。在某些实施例中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在某些实施例中，样品是血液、血浆、血清或尿液。在某些实施例中，白蛋白的选择性底物是脂肪酸的硝基苯基酯或脂质。在某些实施例中，白蛋白的选择性底物是脂肪酸或脂质的(对、间、邻或二)硝基苯基酯。在某些实施例中，白蛋白的选择性底物是脂肪酸的对硝基苯基酯。在某些实施例中，HSA的选择性底物是1-肉豆蔻酰基-2-(4-硝基苯基丁二酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0NPSPC)。在某些实施例中，水解产物具有比色或荧光特性，其使得能够通过光度或荧光检测器有效检测水解产物。在某些实施例中，水解产物是硝基苯酚。在某些实施例中，水解产物通过在约405nm的波长下的吸收检测。在某些实施例中，HSA伪酯酶活性通过在405nm下的增加率评定。在某些实施例中，HSA伪酯酶活性通过在405nm下的最终吸收增加评定。在某些实施例中，酯酶抑制剂是含有氟磺酰基(磺酰氟)官能团的化合物。在某些实施例中，酯酶抑制剂是含有苯磺酰氟官能团的化合物。在某些实施例中，酯酶抑制剂是4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(PefablocSC)或苯甲基磺酰氟。在某些实施例中，酯酶抑制剂是苯基甲基磺酰氟(PMSF)。在某些实施例中，在分析之前，生物样品可用酯酶抑制剂预处理。在某些实施例中，酯酶抑制剂和白蛋白的选择性底物含于一种溶液中。在另一方面中，本公开提供一种用于检测确定样品中白蛋白的量的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒包含选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂。试剂盒进一步包含白蛋白的选择性底物，所述底物具有羧酸酯键，使得当底物暴露于样品中的白蛋白时，羧酸酯键裂解以产生水解产物。在某些实施例中，试剂盒进一步包含白蛋白的标准对照。附图说明图1展示人血清中的白蛋白和非白蛋白酯酶活性。人血清通过Superose-6柱分级。并且使用14:0NPS-PC，在存在或不存在HSA伪酯酶活性的抑制剂或遏制剂的情况下鉴别每个级分中的酯酶活性。在不存在HSA抑制剂的情况下，鉴别出酯酶活性的三个主要级分。当HSA的酯酶活性受抑制时，第三峰消失，表明最后一个峰是HSA的酯酶活性。图2展示根据本公开的一实施例的分析的结果。图3展示使用14:0NPS-PC作为探针的HSA伪酯酶的米氏(Michaelis-Menten)动力学。14:0NPS-PC在HSA的伪酯酶反应中具有相对低的Km，并且因此HSA浓度的测量可以灵敏且快速。图4展示相比于白蛋白的伪酯酶活性，与LDL或HDL相关的酯酶活性对PefablocSC敏感得多。在1.5mM14:0NPS-PC、pH7.4中，15-20mM(最终浓度)的PefablocSC可消除所有非白蛋白酯酶活性，但维持>90％的白蛋白伪酯酶活性。图5展示在HSA与纯化的LDL和HDL相关酯酶活性对与2mMPefablocSC一起培育的不同敏感度。当与2mMPefablocSC一起培育约6-10小时时，与LDL和HDL相关的酯酶活性完全失活。在相同条件下未观察到HSA伪酯酶活性的失活。图6展示在24℃下培育1小时时，约1mM的PefablocSC使人血清非HSA酯酶活性完全失活。图7展示可通过在24℃下与1mMPefablocSC一起培育约15分钟，使人血清非HSA酯酶活性完全失活。图8展示在固定底物浓度的情况下提高HSA浓度引起R2的线性度的降低。图9展示用于获得最好的HSA量化曲线线性度的最优底物/HSA比率。基于该图，可针对HSA量化分析的不同格式确定最优底物浓度。图10展示在所述条件下HSA的量化中，通过反应速率或终点阅读分析未观察到差异。图11展示白蛋白伪酯酶活性可受Ca2+和Cu2+影响。图12展示达雷帕地(Darapladib)对人血清中的Lp-PLA2的抑制作用。图13展示DMSO、EDTA以及Tween-20对白蛋白伪酯酶活性的作用。图14展示白蛋白信号和人血清反应体积的相关性。图15展示标准曲线和参数。图16展示检测到的白蛋白(mg/mL)与预期白蛋白(mg/mL)的二元拟合。...

【技术保护点】
1.一种用于确定样品中白蛋白的量的方法，所述方法包含：/n用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂处理所述样品；/n将所述样品与白蛋白的选择性底物组合，所述选择性底物具有羧酸酯键，使得所述羧酸酯键裂解以产生水解产物；/n检测在一时间段内产生的所述水解产物的量；以及/n基于所述时间段内所述水解产物的量，确定所述样品中所述白蛋白的量。/n

【技术特征摘要】
20191121 US 62/938,3341.一种用于确定样品中白蛋白的量的方法，所述方法包含：
用选择性抑制非白蛋白酯酶活性的酯酶抑制剂处理所述样品；
将所述样品与白蛋白的选择性底物组合，所述选择性底物具有羧酸酯键，使得所述羧酸酯键裂解以产生水解产物；
检测在一时间段内产生的所述水解产物的量；以及
基于所述时间段内所述水解产物的量，确定所述样品中所述白蛋白的量。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述白蛋白是人血清白蛋白HSA。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清或尿液。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性底物是脂肪酸或脂质的硝基苯基酯。


5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：卓少秋，
申请(专利权)人：图纳蒙特生物创业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US