本发明专利技术涉及高效液相色谱法检测一种慢病毒包装系统辅助质粒超螺旋含量的方法，利用高效液相色谱法进行测定，通过回收高效液相色谱主峰，并且进行鉴定，其可以作为质粒超螺旋结构工作标准品。结果表明，用该方法对BZK2质粒超螺旋结构进行检测，其纯度达84.71％，该方法专属性强、操作简单、灵敏度高、结果准确，适用于质粒制品超螺旋结构纯度的检测。于质粒制品超螺旋结构纯度的检测。于质粒制品超螺旋结构纯度的检测。
【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒包装系统辅助质粒的超螺旋结构纯度的检测方法
[0001]本专利技术涉及药物分析领域，具体涉及一种利用高效液相色谱法检测质粒DNA超螺旋结构纯度的方法。
技术介绍
[0002]质粒(plasmid)广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。从分子组成看，有DNA质粒，也有RNA质粒；从分子构型看，有线型质粒、也有环状质粒，其表型也多种多样。细菌质粒是基因工程中最常用的载体。质粒(plasmid)是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分，是染色质外的双链共价闭合环形DNA，可自然形成超螺旋结构。
[0003]质粒DNA是一类能在细菌染色体外自主复制的环形双链DNA分子。不同类型的质粒DNA分子量大小不同，大的可达105kDa，小的则仅为103kDa。质粒DNA有三种不同的构型：
[0004]①
共价闭合环形DNA所呈现的超螺旋结构(SC构型)，在电泳图谱中，其处于凝胶的前面；
[0005]②
一条链保持完整的环形结构，另一条链上有一个至数个缺口的、开环的DNA所呈现的开环构型(OC构型)，其走在凝胶的后面；
[0006]③
双键断裂的DNA呈现的线性结构(L构型)其走在凝胶的中间部位。
[0007]由于超螺旋质粒DNA转染效率高，可大幅减少用药剂量，所以在DNA疫苗、基因治疗和细胞治疗中使用的质粒DNA为超螺旋构型。但在质粒纯化过程中会造成质粒DNA超螺旋结构的破坏，形成多种不同构型的质粒DNA，从而影响质粒包装效率，因而对质粒DNA超螺旋含量做出准确的定量分析就很有必要。
[0008]现有的检测超螺旋DNA含量技术有琼脂糖凝胶电泳法和毛细管凝胶电泳法，但均存在检测方法上的不足，如毛细管凝胶电泳法需要繁琐的样品前处理过程，且不适合在质粒DNA生产的每一步中使用；琼脂糖凝胶电泳法在OD
260
波长下检测范围太窄，并且样品稀释过程中很容易造成误差，准确度很低，也不适合在质粒DNA生产的每一步中使用。更重要地，上述两种方法均无法定量地检测超螺旋DNA的含量。
技术实现思路
[0009]针对现有技术中存在的缺点与不足，本专利技术的目的是提供一种高效液相色谱法检测一种质粒超螺旋结构纯度的方法，使用Waters e2695型高效液相色谱仪对一种慢病毒包装系统辅助质粒BZ2K进行高效液相色谱分析检测，通过采用外标法即可快速计算出样品中超螺旋结构所占比例。
[0010]本专利技术的一个方面，提供一种质粒超螺旋纯度的高效液相色谱检测方法，该方法包括如下步骤：
[0011](1)使用Waters e2695型高效液相色谱仪和赛分Proteomix SAX强阴离子交换色谱柱
[0012](2)检测条件的选择：
[0013]①
检测波长为260nm；
[0014]②
流速为0.5mL/min；
[0015]③
柱温为35℃；
[0016]④
上样量20μL；
[0017]⑤
流动相A为20mmol/L Tris pH8.0溶液；
[0018]⑥
流动相B为20mmol/L Tris 1mol/L NaCl pH8.0溶液；
[0019]⑦
洗脱梯度改变量为1％。
[0020](3)质粒各构型工作标准品的制备：采用单酶切的方式获得线性结构工作标准品；采用回收液相色谱图中的杂峰和主峰的方式获得开环结构和超螺旋结构工作标准品，并结合琼脂糖凝胶电泳的方法和高效液相色谱的方法再次对获得的待定开环结构和超螺旋结构工作标准品进行验证确认；
[0021](4)利用确认的超螺旋结构工作标准品，结合优化后的色谱检测条件对供试品进行超螺旋结构纯度的检测。
[0022]综上所述，本专利技术的有益效果至少包括如下：
[0023]1.摸索获得一套色谱纯化参数，在该套参数下获得的超螺旋结构质粒纯度可高达99％以上；
[0024]2.制备出一种质粒超螺旋结构工作标准品，采用外标标曲法即可准确测定质粒中超螺旋结构纯度，该分析方法简便、快速、灵敏度高，比常规的凝胶电泳法有更高的分辨率。
附图说明
[0025]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。
[0026]图1为BZ2K质粒结构图；
[0027]图2为TSKgel DNA
‑
NPR色谱柱BZ2K质粒高效液相色谱图；
[0028]图3优化实验中洗脱梯度以0.8％改变时BZ2K质粒高效液相色谱图；
[0029]图4优化实验中洗脱梯度以1％改变时BZ2K质粒高效液相色谱图；
[0030]图5 BZ2K质粒优选参数下的高效液相色谱图；
[0031]图6质粒各构型的琼脂糖凝胶电泳图；
[0032]图7 BZ2K质粒超螺旋标准品色谱图；
[0033]图8 BZ2K质粒中加入开环结构色谱图；
[0034]图9 BZ2K质粒中加入超螺旋结构、线性结构色谱图；
[0035]图10 BZ2K质粒超螺旋结构工作标准品纯度的凝胶电泳检测结果；
[0036]图11空白进样色谱图；
[0037]图12系统适用性验证结果；
[0038]图13标准曲线。
具体实施方式
[0039]下面将结合实施例对本专利技术的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的
实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0040]实施例1：检测条件的筛选和优化
[0041]BZ2K质粒是慢病毒包装过程中的必需辅助质粒之一，其结构如图1所示。使用Waters e2695型高效液相色谱仪和TSKgel DNA
‑
NPR色谱柱对BZ2K质粒各个结构进行分离。
[0042]实验1：
[0043]检测波长 260nm；
[0044]流速 0.5ml/min；
[0045]柱温 35℃；
[0046]上样量 20μL(2μg)；
[0047]流动相A：20mmol/L Tris pH8.8溶液；
[0048]流动相B：20mmol/L Tris 1mol/L NaCl pH8.8溶液；
[0049]洗脱梯度 1％(表1)。
[0050]表1
[0051]时间(分钟)流动相A％流动相B％0505055050451090505050
[0052]结果如图2所示，发现TSKgel DNA
‑
NPR色谱柱的色谱图中BZ2K质粒的不同组份(超螺旋结构质粒和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种质粒超螺旋纯度的高效液相色谱检测方法，该方法包括如下步骤：(1)使用Waters e2695型高效液相色谱仪和赛分Proteomix SAX强阴离子交换色谱柱；(2)色谱检测条件：
①
检测波长为260nm；
②
流速为0.5mL/min；
③
柱温为30
‑
35℃；
④
上样量20μL；
⑤
流动相A为20mmol/LTris pH7.5～8.0溶液；
⑥
流动相B为20mmol/LTris 1mol/L NaClpH7.5～8.0溶液；
⑦
洗脱梯度改变量1％；(3)质粒各构型工作标准品的制备：采用单酶切的方式获得线性结构工作标准品；采用回收液相色谱图中的杂峰和主峰的方式获得开环结构和超螺旋结构工作标准品，并结合琼脂糖凝胶电泳的方法和高效液相色谱的方法再次对获得的待定开环结构和超螺旋结构工作标准品进行验证确认；(4)利用确认后的步骤(3)所述的超螺旋结构工作标准品，结合步骤(2)所述的色谱检测条件对供试品进行超螺旋结构纯度的检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中柱温为35℃，流动相pH为8.0。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括如下步骤：(1)质粒线性结构工作标准品制备取2
‑
5μg质粒，用MluI
‑
HF对质粒进行单酶切，将单酶切产物进行醇化，醇化后产物用流动相...
【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，张琴星，马传艳，彭波，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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